台湾专利TW201305190A 新穎之抗原

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专利摘要:
本發明係關於巨細胞病毒(CMV)gB多肽，其包含至少一部分gB蛋白胞外域，該胞外域包含融合環1(FL1)結構域及融合環2(FL2)結構域，其中該FL1結構域及該FL2結構域中之至少一者包含至少一個胺基酸缺失或取代。
公开号:TW201305190A
申请号:TW100137497
申请日:2011-10-14
公开日:2013-02-01
发明作者:Guy Jean Marie Fernand Pierre Baudoux；Normand Blais；Martine Marchand
申请人:Glaxosmithkline Biolog Sa；
IPC主号:A61K39-00

专利说明:
新穎之抗原
本發明係關於免疫學領域。詳言之，本發明提供用於引發對巨細胞病毒(CMV)有特異性之免疫反應的組合物(諸如疫苗)以及方法。
人類巨細胞病毒(HCMV)為普遍存在之DNA病毒且屬於帶狀疱疹病毒家族。HCMV由DNA核、外部衣殼構成且由併有病毒特異性醣蛋白之脂質膜覆蓋。
HCMV為全世界大部分地區之地方病。然而，初次感染通常導致亞臨床疾病，此後病毒潛伏且保留在隨後任何時間再活化的能力。然而，HCMV在兩個群體中造成嚴重醫學病況。HCMV為子宮內感染之新生兒的先天性缺陷之主要原因。此為已開發世界中先天性感染之最常見病因。先天性感染係指新生兒出生前母親傳遞給胎兒的感染。在先天性感染的新生兒中，5-10%在出生時具有以下主要臨床症狀，諸如小頭、顱內鈣化及肝炎。許多具有先天性HCMV感染之嬰兒在出生時無症狀。然而，隨診研究已顯示15%該等嬰兒將具有後遺症，諸如聽力損失或中樞神經系統異常，尤其造成不良智力表現。
處於風險中之第二群體為免疫功能不全患者，諸如罹患HIV感染之彼等患者及經歷移植之彼等患者。在此情形下，病毒成為機會性病原體且引起具有高發病率及死亡率之嚴重疾病。臨床疾病引起多種症狀，包括發熱、肝炎、肺炎及傳染性單核白血球增多症。
為了致力於HCMV相關疾病，開發出候選疫苗，包括活的減毒疫苗及次單位疫苗。詳言之，最近在II期臨床試驗中測試與MF59^TM乳液組合之次單位疫苗，該次單位疫苗包含缺失跨膜結構域之經修飾醣蛋白B(gB)(WO 2009/037359，N. Engl. J. Med. 2009;360: 1191-9)。
在本發明之第一態樣中，提供一種巨細胞病毒(CMV)gB多肽，其包含具有融合環1(FL1)結構域及融合環2(FL2)結構域之gB蛋白胞外域的至少一部分，其中FL1及FL2結構域中之至少一者包含至少一個胺基酸缺失或取代。
在第二態樣中，提供一種CMV gB多肽，其包含至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%前導序列胺基酸或整個前導序列的缺失。
在第三態樣中，提供一種CMV gB多肽，其具有選自由以下所述之序列組成之群的序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21。
在第四態樣中，提供一種包含CMV gB多肽群體之製劑，其中該群體之至少50%、至少60%或至少70%呈三聚形式。
在第五態樣中，提供一種免疫原性組合物，其包含與適合醫藥載劑混合的本發明之CMV gB多肽。
在另一態樣中，提供一種編碼本發明之CMV gB多肽的聚核苷酸。
在另一態樣中，提過一種聚核苷酸，其具有選自由以下所述之序列組成之群的序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17。
在另一態樣中，提供一種包含本發明之聚核苷酸的重組載體。
在另一態樣中，提供一種以本發明之重組載體轉型之宿主細胞。
在另一態樣中，提供一種本發明之CMV gB多肽的用途，其係用於製備用以預防及/或治療CMV感染之藥物。
在另一態樣中，提供本發明之CMV gB多肽，其係用於預防及/或治療CMV感染。
在另一態樣中，提供一種用於引發針對CMV之免疫反應的方法，其包含向個體投與免疫有效量之包含本發明之CMV gB多肽之組合物的步驟。序列表之描述
SEQ ID NO:1-來自CMV AD169病毒株的全長gB多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:2-來自CMV AD169病毒株的gB-DeltaTM多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:3-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP12多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Del2多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:5-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP1-Del2多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:6-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP12多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP1-Del2多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP12-Del2多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP12-Delta725多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta725多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP12-Delta113多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta113多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:13-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP12-Delta725-LVL759(或LVL759)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta725-LVL759(LVL759)多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:15-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP12-Delta725-LVL776(或LVL776)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta725-LVL776(或LVL776)多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:17-編碼來自CMV AD169病毒株之gB-SLP12-Delta725-CD33(或CD33)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18-來自CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta725-CD33(或CD33)多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:19-來自成熟形式之CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta725-LVL759(或LVL759)多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:20-來自成熟形式之CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta725-LVL776(或LVL776)多肽之胺基酸序列。
SEQ ID NO:21-來自成熟形式之CMV AD169病毒株的gB-SLP12-Delta725-CD33(或CD33)多肽之胺基酸序列。
本發明係關於呈現優良免疫原性及出色的加工特徵之新穎CMV gB多肽。本發明之gB多肽尤其適用作供納入免疫原性組合物(諸如疫苗)中之抗原。詳言之，本發明之gB多肽展現改良之均質產物概況。實際上，本發明者觀察到，先前技術之gB多肽(諸如缺乏跨膜結構域之gB多肽(gB-DeltaTM))一旦表現即組裝成不同尺寸之多聚體，包括高分子量多聚體，使得群體呈現異質。亦觀察到，多聚體概況不一致，這是因為各實驗中既定尺寸之多聚體的比例不同。就疫苗調配物而言，此類型之變化性及不一致性不可接受。因此，仍需要呈現改良均質性及一致性概況產物的CMV gB多肽。再者，聚集成高分子量多聚體可能對重組多肽之後續加工及純化具有不利影響，這是因為聚集尤其可能導致多肽的溶解性較低形式。因此，仍需要呈現改良加工特徵之CMV gB多肽。
EP 0 802 979中描述缺乏跨膜結構域之CMV gB多肽。
驚奇的是，本發明者觀察到在該缺乏跨膜結構域之CMV gB多肽的特定區域中引入突變導致改良之概況產物，使得該群體不僅比相應未突變多肽更均質，而且亦展現各實驗之間一致的概況。詳言之，高分子量多聚體減少且三聚體之比例增加兩倍。通常，三聚體在本發明之CMV gB多肽群體中佔至少50%、適合地至少60%且更適合地至少70%。相較於缺乏跨膜結構域之CMV gB多肽，此等突變不影響所得突變體之表現程度，亦不影響其分泌程度。此等突變位於已知負責誘發免疫反應之CMV gB的抗原決定基外部。所觀察到的由多肽組裝成高分子量多聚體之群體(諸如缺乏跨膜結構域之先前技術多肽)向多肽具有改良三聚概況之群體的遷移與多肽的更容易及更佳純化有關。詳言之，本發明者觀察到本發明多肽之純化產率顯著高於用缺乏跨膜結構域之先前技術CMV gB多肽獲得的純化產率。產率改良至少2倍，且可能至少3倍至5倍。此外，顯示本發明之新穎多肽的其他突變產生比先前技術多肽更有效表現及分泌之多肽。該特性呈現在用於疫苗製造之抗原產量方面的顯著優勢，在疫苗製造領域中抗原產量通常為限制因素。
本發明者亦觀察到先前技術gB多肽(諸如缺乏跨膜結構域之CMV gB多肽)在多肽之N端及C端末端呈現異質性。其實際上觀察到gB之C端細胞質域中出現的剪裁使得在細胞中之重組表現及分泌後產生至少兩種不同形式的具有不同尺寸之多肽。為了納入免疫原性組合物(諸如疫苗)中，在主要由單一形式構成的情況下較佳使用均質gB多肽群體。本發明者發現，當缺失至少部分C端細胞質域時，不再出現剪裁，且所得多肽群體主要由單一形式之gB構成。
類似地，觀察到先前技術gB多肽(諸如缺乏跨膜結構域之CMV gB多肽)在多肽之N端部分中呈現異質性。實際上，本發明者觀察到信號序列在重組表現及分泌多肽之後由不同胺基酸位置處之信號肽酶裂解，因此產生在N端具有變化末端之gB成熟多肽群體，亦即由在N端具有不同胺基酸之gB多肽構成之群體。此現象亦稱為信號肽酶「擺動(woobling)」。出於功效之目的，且尤其為了一致性，在疫苗領域中重要的是待納入疫苗中之抗原儘可能地均質且儘可能不降解，使得疫苗批次可生產及一致。
在本發明中應瞭解，改良之均質產物概況意謂本發明之CMV gB多肽群體在重組表現後例如如分析型超速離心所量測由至少50%三聚體構成(參看實例2，第1.2節)。通常，包含本發明CMV gB多肽群體之製劑由至少50%、適合地至少60%且更適合地至少70%三聚體構成。該至少50%三聚體之概況在本說明書中亦將稱為「改良之三聚概況」或「三聚體增濃概況」。此等術語將被視為是同義的且可互換。
當提及多肽之C端部分的「均質性/異質性」時，異質群體意謂群體由至少兩種具有不同尺寸之多肽構成，而均質群體應理解為主要由既定尺寸之單一多肽構成的群體。
當提及多肽之N端部分的「均質性/異質性」時，異質群體意謂群體由各在N端以不同胺基酸開始之不同成熟多肽構成。反之，根據本發明，均質群體應理解為主要由單一成熟多肽構成的群體，該多肽無變化地在N端以相同既定胺基酸開始。在本發明中，「成熟」多肽係指信號序列已裂解移除之多肽。通常，在本發明之N端均質群體中，超過30%、適合地至少80%、更適合地80%至90%、更適合地至少99%裂解信號序列後產生的成熟多肽在N端以相同胺基酸開始。因此，在一個實施例中，提供一種包含在裂解信號序列後產生之成熟CMV gB多肽群體的製劑，其中至少30%、至少80%、80%至90%成熟gB多肽在N端末端包含相同胺基酸。特別地，本發明之成熟多肽適合地在N端位置以絲胺酸或組胺酸開始。
gB為具有許多作用之包膜醣蛋白B，其中一者涉及巨細胞病毒與宿主細胞之融合。其由HCMV基因組之UL55基因編碼。天然gB形式之尺寸視可能根據病毒株略微變化之開放閱讀框架(ORF)的尺寸而定。舉例而言，AD169病毒株之ORF的長度為2717 bp，其編碼906個胺基酸的全長gB，而Towne病毒株之ORF編碼907個胺基酸的全長gB。儘管本發明適用於源自任何CMV病毒株之gB蛋白，但為了便於理解，當本說明書中提及胺基酸位置時，除非另外說明，否則所示編號係相對於源自AD169病毒株之SEQ ID NO:1的gB多肽之胺基酸序列。然而，本發明不限於AD169病毒株。一般技術者可藉由使用容易獲得且熟知的比對演算法(諸如BLAST)比對胺基酸序列來測定任何其他CMV病毒株之gB多肽中的相當胺基酸位置。因此，當提及「其他CMV gB多肽」時，應理解為不同於AD169之任何病毒株的CMV gB多肽。天然形式之AD169 gB在該蛋白質的N端至C端方向含有(亦參看圖1)(i)已知涉及該多肽胞內運輸(包括靶向該多肽以使其分泌)之胺基酸信號序列或信號肽，接著(ii)稱為前導序列之區域，(iii)在SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸456與460之間含有弗林蛋白酶(furin)型內切蛋白分解裂解位點之胞外域，(iv)跨膜結構域及(v)C端細胞質域。此外，基於與源自不同疱疹病毒(諸如HSV)之gB蛋白序列比對，已識別出CMV gB之胺基酸序列中作為推定融合環之胺基酸段(Backovic等人,2007. J. Virol. 81(17): 9596-600)。已以實驗方式確定HSV融合環(Hannah,B.P.等人,2009. J. Virol. 83(13): 6825-6836)。該等段因為涉及病毒與宿主細胞之融合而如此稱呼。根據上述文獻，藉由CMV gB中之序列比對識別出兩個推定融合環，其在本說明書其餘部分稱為FL1及FL2。該等融合環位於該蛋白質跨膜結構域上游的胞外域中。
本發明者驚奇地觀察到藉由使特定胺基酸突變而破壞具有非功能跨膜結構域之CMV gB多肽的融合環FL1及FL2，產生在表現時相較於具有非功能跨膜結構域但具有完整融合環之CMV gB多肽呈現改良三聚概況之產物。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽包含突變，諸如融合環FL1或FL2中之至少一者或可能兩者的胺基酸取代或缺失。適合地，本發明之多肽在融合環FL1中包含至少一個胺基酸取代或缺失。適合地，本發明之多肽在融合環FL2中包含至少一個胺基酸取代或缺失。更適合地，本發明之CMV gB多肽包含融合環FL1及FL2兩者之突變，且該突變之CMV gB多肽形成本發明之標的。舉例而言，本發明之gB多肽在融合環FL1中包含至少一個胺基酸取代或缺失，且在融合環FL2中包含至少一個胺基酸取代或缺失。
在本發明之含義中，涵蓋CMV AD169 gB之融合環FL1的胺基酸(亦即FL1之胺基酸序列)定義為SEQ ID NO:1中所述序列之¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷。同樣，在本發明之含義中，涵蓋融合環FL2之胺基酸(亦即FL2之胺基酸序列)定義為SEQ ID NO:1中所述序列之²⁴⁰W.L.Y²⁴²。例如，藉由序列比對可識別其他CMV病毒株之gB多肽內相應融合環FL1及FL2序列。該等融合環之破壞可包括與此等胺基酸三聯體有關的任何類型之突變，不管是缺失或點突變，諸如胺基酸取代，由此造成重組表現時具有三聚體增濃、改良概況的產物，亦即相較於非突變形式具有較大比例之三聚形式多肽的產物。
關於FL1之非限制性適合突變為至少一個，適合地至少兩個選自SEQ ID NO:1中所述序列之¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷胺基酸或源自不同病毒株之其他CMV gB多肽中相應位置的胺基酸之胺基酸缺失或經極性胺基酸，尤其非芳族極性胺基酸，更特定言之選自由離胺酸(K)、組胺酸(H)及精胺酸(R)之帶正電胺基酸之群的胺基酸取代。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽(尤其具有非功能跨膜結構域之多肽)具有突變之融合環FL1，其中至少異白胺酸(I¹⁵⁶)、適合地至少酪胺酸(Y¹⁵⁵)、適合地至少酪胺酸(Y¹⁵⁷)經組胺酸(H)取代或缺失。或者，本發明之CMV gB多肽具有突變之融合環FL1，其中至少酪胺酸(Y¹⁵⁷)經精胺酸(R)取代。在一特定實施例中，本發明之CMV gB多肽(尤其具有非功能跨膜結構域之多肽)具有突變之融合環FL1，其中至少異白胺酸(I¹⁵⁶)及酪胺酸(Y¹⁵⁷)分別經組胺酸(H¹⁵⁶)及精胺酸(R¹⁵⁷)取代或缺失。在另一實施例中，本發明之具有非功能跨膜結構域之CMV gB多肽具有突變之融合環FL1，其中至少酪胺酸(Y¹⁵⁵)經甘胺酸(G)取代或缺失，視情況組合異白胺酸(I¹⁵⁶)經組胺酸(H)取代或缺失、或酪胺酸(Y¹⁵⁷)經精胺酸(R)取代或缺失，或與該兩種取代或缺失組合。在一特定實施例中，本發明之具有非功能跨膜結構域之CMV gB多肽具有突變之融合環FL1，其中SEQ ID NO:1中所述序列之三個胺基酸¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷或源自不同病毒株之其他CMV gB多肽中相應位置的胺基酸經胺基酸¹⁵⁵G.H.R¹⁵⁷取代或缺失。FL1結構域之突變可以替代方式定義。如下文所述，特定胺基酸序列之疏水性可使用疏水性量表，諸如凱特及杜立德量表(Kyte and Dolittle scale)(Kyte等人,1982. J. Mol. Bio. 157: 105-132)測定。涵蓋胺基酸¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷之FL1結構域達到彼量表上+1.9之評分。在一實施例中，在本發明之CMV gB多肽中，位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置155-157處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸Y.I.Y之段經如使用凱特及杜立德量表所量測疏水性評分小於-3，尤其小於-7，更特定言之小於-8的三個胺基酸之段取代。所有三個胺基酸可能不會同時取代，只要胺基酸段之整體評分達到上文規定之值即可。舉例而言，三個胺基酸長段中僅一個或兩個胺基酸可經取代，則基於經取代胺基酸(亦即一個或兩個)的一致性分別加上天然胺基酸(兩個或一個)的一致性計算評分。
關於融合環FL2之非限制性適合突變為至少一個，適合地至少兩個選自SEQ ID NO:1中所述序列之²⁴⁰W.L.Y²⁴²或源自不同病毒株之其他CMV gB多肽中之相應位置的胺基酸之胺基酸缺失或經選自由離胺酸(K)、組胺酸(H)及精胺酸(R)組成之群的帶正電胺基酸，適合地組胺酸(H)取代。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽具有突變之融合環FL2，其中至少酪胺酸(Y²⁴²)，適合地至少白胺酸(L²⁴¹)，適合地至少色胺酸(W²⁴⁰)經組胺酸(H)取代，或缺失，視情況與如上文所述之突變之融合環FL1組合。在特定實施例中，本發明之CMV gB多肽具有突變之融合環FL2，其中SEQ ID NO:1中所述序列之三個胺基酸²⁴⁰W.L.Y²⁴²或源自不同病毒株之其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸經胺基酸²⁴⁰A.F.H²⁴²取代，視情況與如上文所述之FL1突變組合。
與FL1及/或FL2融合環有關之突變不限於上文所述之突變。不管是否包括上文所述之突變，可進行其他突變，諸如使SEQ ID NO:1中所述序列之上述三聯體¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷及²⁴⁰W.L.Y²⁴²周圍的胺基酸或源自不同病毒株之其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸突變，只要所得突變多肽呈現改良之三聚體增濃概況，且該等其他突變不干擾多肽在宿主細胞中重組表現時的產量(表現及分泌)、加工或穩定性即可。
本發明者亦觀察到，至少一個融合環(FL1及/或FL2)突變(諸如任一上述突變)與多肽之C端細胞質域的其他突變之組合亦提供具有改良之三聚概況的CMV gB多肽。在本發明之意義上，gB CMV多肽之C端細胞質域應理解為位於跨膜結構域下游的結構域(亦參看圖1)。特定言之，C端細胞質域之其他突變適合地關於疏水性區域、適合地脯胺酸增濃區域、適合地高度親水性帶負電區域、可能其中所有區域之缺失。作為一非限制性實例，適合突變對應於SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸825至877(稱為Del2)的缺失。上述缺失序列之描繪不嚴格限於胺基酸位置825至877且可變化，只要所得突變多肽呈現改良的三聚體增濃概況，且不影響在宿主細胞中重組表現時的產量、加工或穩定性即可。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽包含至少一個融合環(FL1及/或FL2)(適合地FL1)之突變，及C端細胞質域中至少一個疏水性區域、一個脯胺酸增濃區域及一個高度親水性區域的缺失，尤其是SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸825至877(Del2)的缺失。
胺基酸序列或其片段之疏水性由構成此序列或其片段之胺基酸的類型規定。胺基酸通常根據其側鏈分為不同組。舉例而言，一些側鏈被視為非極性，亦即疏水性，而其他的被視為極性。在本發明之意義上，丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、異白胺酸(I)、甲硫胺酸(M)、脯胺酸(P)、苯丙胺酸(F)及色胺酸(W)被視為疏水性胺基酸之部分，而絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)、酪胺酸(Y)、半胱胺酸(C)、離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)、天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)被視為極性胺基酸之部分。不管其疏水性，胺基酸亦基於其側鏈通常共有之性質分為子組。舉例而言，苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸被共同分為芳族胺基酸且在本發明之含義內將被視為芳族胺基酸。天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)為酸性或帶負電胺基酸之部分，而離胺酸(K)、精胺酸(R)及組胺酸(H)為鹼性或帶正電胺基酸之部分，且其在本發明意義上將同樣考慮。可獲得疏水性量表，其利用20個胺基酸每一者之疏水性及親水性特性且對各胺基酸分配疏水性評分，因此形成疏水性分級。僅作為說明性實例，可引用上文論述之凱特及杜立德量表(Kyte等人,1982. J. Mol. Bio. 157: 105-132)。此量表允許計算預定長度之區段內的平均疏水性。因此，熟練技術人員可識別作為本發明突變之潛在目標的胺基酸序列中之疏水性區域。接著可如下文所述測試該等區域之突變誘導所得突變蛋白之改良產物概況(亦即促進群體中之三聚體比例)的能力。疏水性區域之突變可存在於如上文所述之該區域之缺失、或其部分、或該區域內以極性胺基酸取代疏水性胺基酸之點突變中。將藉由分析在宿主細胞中重組表現後該突變對突變多肽之產物概況的所得作用測定突變之相關性，亦即相關突變欲誘導至少50%，適合地至少60%且更適合地至少70%三聚體存在於突變多肽群體中的改良之三聚體增濃概況。本發明者觀察到，C端細胞質域可以不同程度缺失，同時保持如上文所述的改良之產物概況。因此，本發明涵蓋CMV gB多肽，其中適合地10%，更適合地20%，更適合地60%，更適合地80%、更適合地90%細胞質域胺基酸缺失。可能會缺失整個細胞質域。特定言之，本發明者觀察到，當缺失至少70%，適合地至少80%或更多細胞質域時，所得CMV gB多肽在宿主細胞中重組表現時顯示較佳表現及分泌程度。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽包含至少一個融合環(FL1及/或FL2)，適合地FL1，或有可能其兩者之突變，及整個細胞質域的缺失，例如SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸776至906或其他CMVgB多肽中之相應位置處的胺基酸。
允許根據尺寸或密度區分群體內各成分(諸如可能彼此聚集之經純化多肽)之任何方法可用於監測產物概況，且因此用於判定既定突變是否賦予如上文所述之經改良概況產物。適合方法可基於沈降，諸如分析型超離心(AUC)；或層析，詳言之尺寸排阻層析法，諸如基於UV之尺寸排阻層析法(SEC-UV)。或者，用於評估蛋白質或多肽樣品內的聚集程度之方法可以是以交聯劑處理樣品，從而在兩個或兩個以上蛋白質或多肽之間形成共價鍵。戊二醛可適用作交聯劑。交聯後，將樣品裝載至變性條件下的凝膠(諸如SDS-PAGE)上，且針對蛋白質之存在例如以庫馬斯藍(Coomassie blue)或硝酸銀染色凝膠，將展現聚集體(若存在)，其根據分子量分離。平行裝載由已知分子量之蛋白質構成的階梯將允許測定不同聚集體之分子量。只要已知最小單元(諸如其單體形式之多肽)的分子量，則所觀測之聚集體分子量將為聚集體內多聚程度之指示。舉例而言，缺失跨膜結構域之CMV AD169 gB多肽的長度為838個胺基酸。若認為胺基酸之平均分子量為110 kDa，則此多肽之預期分子量為92 kDa。因此，若該多肽聚集，則所得多聚體之平均分子量預期將為92之倍數。特定言之，若形成三聚體，則由3個缺失跨膜結構域之gB分子構成的該等三聚體之預期平均分子量為276 kDa。
融合環FL1及/或FL2中之任何上述突變可與其他突變組合。特定言之，本發明之CMV gB多肽應理解為具有非功能跨膜結構域且包含其他特定突變，諸如融合環突變。可藉由使用能夠自胺基酸序列用公式表示親水性量表之電腦程式，使用20個胺基酸之疏水性及親水性特性預測跨膜結構域在多肽內之位置(Kyte等人,1982. J. Mol. Bio. 157: 105-132)。隨著程式移動通過序列，連續計算序列之預定長度區段內的平均親水性。接著將此等連續親水性評分自N端至C端繪圖，且中點線對應於多數已知定序蛋白質中發現的胺基酸組合物之總親水性平均值印記(print)。膜結合蛋白展現在對應於嵌入膜之脂質雙層中的序列部分之線的疏水性側之不中斷大區域。跨膜結構域負責將多肽錨固於細胞膜上。在病毒包膜醣蛋白中，跨膜結構域通常在接近多肽之C端部分處含有具有20-27個不帶電的主要呈疏水性之胺基酸之段。如上文所述關於CMV gB之親水性分析之應用的實例可為引用的Spaete等人之公開案(Spaete等人,1988,Virology 167: 207-225)。實際上，作者在來自病毒株AD169及Towne之CMV gB多肽中識別出接近gB多肽之C端的容易顯現為兩個相鄰寬疏水性峰的推定疏水性跨膜結構域。第一個包含胺基酸715至748且第二個包含胺基酸752至772(編號對應於來自如SEQ ID NO:1描繪之AD169病毒株之gB多肽的胺基酸序列)。Reschke等人之公開案(Reschke等人,1995,J. of Gen. Virology 76: 113-122)另外識別作為AD169 CMV gB之推定跨膜結構域的胺基酸751至771之第二段。此兩個公開案因此提出，AD169 CMV gB之推定跨膜結構域包括至少胺基酸751至771，且可能包括胺基酸714至771。在本發明之意義上，CMV gB多肽之跨膜結構域涵蓋至少SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸701至775或其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸，且因此長度為74個胺基酸。
「非功能跨膜結構域」在本發明含義中應理解為至少部分推定跨膜結構域經改變使得能夠在宿主細胞中表現後自該細胞分泌所得多肽。在一實施例中，本發明之gB多肽缺失整個跨膜結構域。在其他實施例中，本發明之CMV gB多肽保留一部分跨膜結構域。特定言之，CMV gB多肽保留至少5%，適合地至少10%，更適合地至少20%，更適合地至少30%或至少50%跨膜結構域胺基酸。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽中缺失至少50%跨膜結構域胺基酸數目，適合地至少70%，更適合地至少80%，更適合地至少90%及甚至95%跨膜結構域胺基酸數目缺失。根據一特定實施例，藉由缺失SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸701至775或其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸使本發明CMV gB多肽之跨膜結構域變為非功能跨膜結構域。基於測定跨膜結構域在多肽內之位置的上述預測，缺失程度可進一步變化，只要所得缺失之CMV gB多肽在宿主細胞中表現後自該等細胞分泌即可。跨膜結構域之功能改變不限於胺基酸缺失。改變可以是任何其他類型之胺基酸突變，諸如插入及/或取代。胺基酸之缺失、插入及取代亦可以任何方式組合，只要所得突變CMV gB多肽在宿主細胞中表現後自該等細胞分泌即可。評定既定突變(諸如缺失跨膜結構域之既定部分)對自細胞分泌所得突變多肽之能力的影響在熟練技術人員之能力範圍內。可偵測多肽之分泌且藉由此項技術中已知之任何技術評定分泌程度。作為非限制性說明性實例，可單獨量測保留於細胞內之所表現多肽之含量，且其在表現後分泌至細胞培養物上清液或細胞培養基中。通常，在表現後收集細胞培養物上清液，隨後根據任何常用溶解方法溶解細胞，由此提供兩個部分，一個細胞部分及一個上清液部分。接著可藉由此項技術中已知之任何蛋白質偵測技術量測各部分中之多肽含量。舉例而言，可藉由西方墨點法或ELISA檢定偵測多肽。
「包含至少一部分胞外域」在本發明含義中應理解為治療一部分胞外域包含或涵蓋融合環FL1及FL2。胞外域中在融合環之外的其他胺基酸之數目可變化。本發明多肽中存在的胞外域之適當胺基酸數目或胺基酸百分比應使所得多肽包含抗原決定基且呈現改良之三聚概況。適合地，至少50%、更適合地至少70%、更適合地至少80%及甚至90%胞外域胺基酸保留於本發明多肽中，該百分比必需涵蓋融合環FL1及FL2。在一實施例中，本發明之CMV gB多肽保留整個胞外域，該結構域在兩個融合環FL1及FL2之一者，有可能兩者中包含至少一個突變。
保留「至少一部分細胞質域」意謂表現及分泌必需之胺基酸數目。適合地，本發明之CMV gB多肽包含至少5%，更適合地至少10%，且可能20%或20%以上細胞質域胺基酸。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽中至少80%，至少90%或至少95%細胞質域胺基酸缺失。在另一實施例中，本發明之CMV gB多肽缺失整個細胞質域。
跨膜結構域之突變(諸如缺失其至少部分)可與細胞質域突變(諸如缺失其至少部分)組合。任何組合均涵蓋於本發明中，只要所得突變CMV gB多肽如上文所述在宿主細胞中表現後自該等細胞分泌且呈現改良之三聚概況即可。因此，在特定實施例中，本發明之CMV gB多肽缺失整個跨膜結構域及整個細胞質域。在替代實施例中，本發明之CMV gB多肽缺失整個跨膜結構域且保留至少部分細胞質域，諸如其10%。在其他替代實施例中，本發明之CMV gB多肽缺失整個細胞質域且保留至少30%跨膜結構域。
本發明者驚奇地觀察到，融合環FL1及/或FL2之突變與缺失至少部分細胞質域(可能缺失其全部)及缺失至少部分跨膜結構域(可能缺失其全部)組合，提供與先前技術之多肽相比更有效表現及分泌之多肽。
本發明者亦觀察到，先前技術之CMV多肽的信號序列在重組表現及分泌多肽之後由不同胺基酸位置處之信號肽酶裂解，因此產生在N端具有變化末端之成熟gB多肽群體，亦即由在N端具有不同胺基酸之gB多肽構成之群體。令人驚奇地觀察到在gB多肽之前導序列中引入突變導致信號序列主要在一個位點處裂解，因此產生在N端具有相同胺基酸之成熟gB多肽的均質群體。因此，在一實施例中，提供包含在裂解信號序列後產生之成熟CMV gB多肽群體的製劑，其中至少30%、至少80%、80%至90%成熟gB多肽在N端末端包含相同胺基酸。詳言之，本發明之成熟多肽適合地在N端位置處以絲胺酸或組胺酸開始。本發明之一目標為提供包含至少40%、適合地至少50%、更適合地至少70%、更適合地至少80%或甚至至少90%前導序列胺基酸缺失的CMV gB多肽。在一實施例中，提供包含整個前導序列缺失之CMB gB多肽。本發明者亦觀察到，上述前導序列缺失可與適合地在信號肽之C端部分中之信號序列中出現之突變(諸如至少一個胺基酸取代)組合。或者，該信號序列可包含至少一個胺基酸插入，適合地在信號肽之C端部分中。前導序列之缺失程度以及信號序列之突變類型可變化，只要所得gB多肽在重組表現及分泌後，在一個主要位點處藉由信號肽酶裂解，由此產生在N端具有相同胺基酸之成熟gB多肽群體即可。N端胺基酸在多肽群體中之同一性可藉由此項技術中已知之任何定序技術測定。或者，多肽群體中之不同多肽形式可經受胰蛋白酶消化，且產生之不同肽可藉由質譜(諸如MS/MS)分析。與具有已知序列之標準肽的比較將允許測定經消化肽之胺基酸組成。
本發明者注意到，上述前導序列缺失及/或信號序列突變可與上述關於融合環FL1及FL2結構域之突變及/或至少一部分TM結構域缺失及/或至少一部分細胞質域缺失中之任一者組合，同時仍保持各突變類型賦予之特性，諸如相較於先前技術之CMV gB多肽(諸如gB-DeltaTM)，改良之三聚概況、較佳之表現及分泌、C端剪裁不存在及信號序列裂解後N端之均質性。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽包含前導序列突變，視情況與其中揭示之信號序列突變、任何上文所述之FL1及/或FL2結構域突變、及細胞質域與TM結構域之任何突變組合。
本發明之CMV gB多肽在其不與其在自然界中相同之狀態存在的意義上並非「天然存在」，亦即其序列已經人工修飾。術語「多肽」或「蛋白質」係指單體為胺基酸經醯胺鍵接合在一起的聚合物。如本文所用之術語「多肽」或「蛋白質」欲涵蓋任何胺基酸序列且包括經修飾序列，諸如醣蛋白。術語「多肽」欲特定涵蓋天然存在之蛋白質及重組或合成產生的非天然存在之蛋白質。關於多肽之術語「片段」係指多肽之一部分(亦即子序列)。術語「免疫原性片段」係指保留全長參考蛋白質或多肽的至少一個主要免疫原性抗原決定基之所有多肽片段。多肽內之定向一般陳述為N端至C端方向，由個別胺基酸之胺基及羧基部分之定向限定。多肽自N端或胺基端向C端或羧基端轉譯。
本發明亦可能使用上文所述的具有其他突變之gB多肽，諸如使內源性蛋白分解裂解位點無效之該等位點處之突變。舉例而言，位於SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸456至460或源自不同病毒株之其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸周圍的furin裂解位點可突變。適合地，進行至少一個選自由以下組成之群的胺基酸取代：SEQ ID NO:1中所述序列以T⁴⁵⁶取代R⁴⁵⁶、以Q⁴⁵⁸取代R⁴⁵⁸及以T⁴⁵⁹取代R⁴⁵⁹。因此，在某些實施例中，本發明之CMV gB多肽包含其他點突變，其中SEQ ID NO:1中所述序列之精胺酸R⁴⁵⁶、R⁴⁵⁸及R⁴⁵⁹或源自不同病毒株之其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸分別經蘇胺酸(T⁴⁵⁶)、麩胺酸(Q⁴⁵⁸)及蘇胺酸(T⁴⁵⁹)取代。在一些其他實施例中，SEQ ID NO:1中所述序列之位置50及357處之精胺酸經絲胺酸取代。在其他實施例中，本發明之gB多肽，尤其包含C端細胞質域中疏水性區域缺失之多肽，包含另一點突變，其中SEQ ID NO:1中所述序列之位置778處的半胱胺酸經丙胺酸取代。
視情況，為了促進表現及回收，本發明之gB多肽可在N端包括信號肽。信號肽可選自此項技術中已知之眾多信號肽，且通常經選擇以促進選擇用於重組表現本發明gB多肽之系統中的產量及加工。在某些實施例中，信號肽為天然存在於來自AD169病毒株之天然gB蛋白中之肽，亦即SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸1-20。或者，信號肽可為序列由不同於gB之蛋白質產生的異源序列。適用於本發明之CMV gB多肽情形中的例示性信號肽包括組織纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)、疱疹複合病毒(HSV)gD蛋白、人類內皮抑制素、HIV gp120、CD33、人類Her2Neu或EB病毒(Epstein Barr Virus，EBV)gp350之信號肽。「信號肽」為短胺基酸序列(例如長度約18-25個胺基酸)，其引導新合成之分泌蛋白或膜蛋白至及穿過例如內質網之膜。信號肽通常但並非普遍位於多肽之N端，且通常在蛋白質跨越膜之後由信號肽酶裂解掉。此裂解通常被視為蛋白質「成熟」過程中之步驟。特定言之，一旦信號肽裂解掉，即稱蛋白質為其「成熟」形式。信號序列通常含有三個常見結構特徵：N端極性鹼性區域(n區域)、疏水性核及親水性c區域。根據一實施例，本發明之gB多肽包含天然gB中天然存在之信號肽。在一替代實施例中，本發明之gB多肽包含異源信號肽，諸如蛋白CD33之信號肽。信號序列可為非天然序列且可包含突變，諸如胺基酸取代、插入或缺失。因此，在一些實施例中，其中本發明之gB多肽包含信號肽，尤其天然信號肽，該信號肽包含至少一個胺基酸取代，該取代適合地在信號肽之C端部分中。或者，該信號肽包含至少一個胺基酸插入，該插入適合地在信號肽之C端部分中。
所揭示之本發明之CMV gB多肽可視情況包括添加構成標籤之胺基酸序列，此促進重組表現多肽之後續加工或純化。該標籤可為抗原標籤或抗原決定基標籤、酶促標籤或聚組胺酸標籤。通常，標籤位於多肽之一端或另一端，諸如多肽之C端或N端處。因此，在一些實施例中，本發明之CMV gB多肽包含位於多肽之C端的聚組胺酸標籤。
在某些實施例中，本發明之CMV gB多肽具有選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18或其序列(例如缺乏胺基酸信號序列或具有不同信號序列取代之子序列)。或者，在不同實施例中，本發明之CMV gB多肽具有選自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21之胺基酸序列。
本發明之另一態樣係關於編碼本發明之CMV gB多肽之核酸。其中引入該等核酸或載體之細胞(亦即宿主細胞)亦為本發明之部分。宿主細胞可為細菌細胞，但更通常將為真核細胞，諸如酵母細胞(例如畢赤酵母(pichia))、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞(例如CHO細胞)。根據一實施例，本發明之CMV gB多肽在CHO細胞中重組表現。
術語「聚核苷酸」及「核酸序列」係指至少10個鹼基長的核苷酸聚合形式。核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或任一核苷酸之經修飾形式。該術語包括DNA之單股及雙股形式。「經分離聚核苷酸」意謂聚核苷酸不與產生其之生物體之天然存在基因組中直接鄰接(一個在5'端且一個在3'端)的兩個編碼序列直接鄰接。在一實施例中，聚核苷酸編碼多肽。核酸之5'及3'方向藉由參考個別核苷酸單元之連接性定義，且根據去氧核糖(或核糖)糖環中之碳位置命名。聚核苷酸序列之資訊(編碼)內容在5'至3'方向上讀取。
「重組」核酸為具有並非天然存在之序列或具有藉由人工組合序列之兩個單獨片段形成之序列的核酸。此人工組合可藉由化學合成或更通常藉由人工操縱核酸之經分離區段(例如藉由基因工程技術)完成。「重組」蛋白質為經已引入宿主細胞(諸如細菌或真核細胞)中之異源(例如重組)核酸編碼之蛋白質。核酸可引入具有能夠表現由所引入核酸編碼之蛋白質之信號的表現載體上，或核酸可整合至宿主細胞染色體中。
在某些實施例中，重組核酸為最佳用於在所選原核或真核宿主細胞(諸如哺乳動物、植物或昆蟲細胞)中表現之密碼子。為了促進複製及表現，核酸可引入載體中，諸如原核或真核表現載體中。儘管本文揭示之核酸可包括於多種(包括例如細菌質體；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質體；源自質體與噬菌體DNA之組合的載體；病毒DNA，諸如牛痘、腺病毒、雞痘病毒、假性狂犬病、腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒及許多其他病毒)之任一者中，但載體最通常將為適於產生多肽表現產物之表現載體。在表現載體中，編碼CMV gB多肽之核酸通常接近且朝向適當轉錄控制序列(啟動子及視情況選用之一或多個強化子)排列以指導mRNA合成。亦即，所關注聚核苷酸序列可操作地連接於適當轉錄控制序列。該等啟動子之實例包括：CMV之即刻早期啟動子、LTR或SV40啟動子、桿狀病毒之多面體啟動子、大腸桿菌lac或trp啟動子、噬菌體T7及λPL啟動子、及已知控制原核或真核細胞或其病毒中之基因表現的其他啟動子。表現載體通常亦含有用於轉譯起始之核糖體結合位點及轉錄終止子。載體視情況包括用於擴增表現之適當序列。此外，表現載體視情況包含一或多個可選標記基因以提供用於選擇經轉型宿主細胞之表型性狀，諸如真核細胞培養物之二氫葉酸還原酶、新黴素(neomycin)耐藥性或康黴素(kanamycin)耐藥性，或諸如大腸桿菌中之四環素(tetracycline)或安比西林(ampicillin)耐藥性。
表現載體亦可包括其他表現元件，例如以改良轉譯效率。此等信號可包括ATG起始密碼子及相鄰序列。在一些情形中，例如轉譯起始密碼子及相關序列元件與所關注聚核苷酸序列(例如天然起始密碼子(start codon))同時插入適當表現載體中。在該等情形中，不需要其他轉譯控制信號。然而，在僅插入多肽編碼序列或其部分的情形中，提供外源轉譯控制信號(包括ATG起始密碼子)用於表現CMV gB序列。起始密碼子置於正確閱讀框架中以確保轉譯所關注聚核苷酸序列。外源轉錄元件及起始密碼子可具有多種來源(天然及合成)。若需要，則可藉由納入對所用細胞系統適當之強化子進一步提高表現效率(Scharf等人,(1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62；Bitter等人,(1987)Methods in Enzymol 153:516-544)。
足以指導一般技術者製造重組CMV gB核酸之例示性程序可見於Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(及2003之增刊)；及Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,第4版,Wiley & Sons,1999中。
編碼本發明CMV gB多肽之例示性核酸由SEQ ID NO: 6、7、8、9、11、13、15及17表示。熟習此項技術者可製造與例示性變異體共有序列一致性之其他序列變異體。通常，核酸變異體將編碼不超過1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%核苷酸或胺基酸不同之多肽。亦即，編碼之多肽共有至少80%、或85%、更通常至少約90%或90%以上，諸如95%，或甚至98%或99%序列一致性。熟習此項技術者應馬上理解，編碼CMV gB多肽之聚核苷酸序列由於遺傳密碼之冗餘度而本身可共有較少序列一致性。
熟習此項技術者應瞭解，CMV gB多肽與聚核苷酸序列之間的相似性(一般針對多肽及核苷酸序列)可根據序列之間的相似性(又稱為序列一致性)表示。序列一致性常根據一致性(或相似性)百分比量測；百分比越高，兩個序列的一級結構越相似。一般而言，兩個胺基酸(或聚核苷酸)序列的一級結構越相似，摺疊及組裝產生之更高級結構越相似。CMV gB多肽及聚核苷酸序列之變異體可具有一個或少量胺基酸缺失、添加或取代，但仍將共有極高百分比的其胺基酸，且一般共有其聚核苷酸序列。此項技術中熟知測定序列一致性之方法。多種程式及比對演算法描述於：Smith及Waterman,Adv. Appl. Math. 2:482,1981；Needleman及Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443,1970；Higgins及Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins及Sharp,CABIOS 5:151,1989；Corpet等人,Nucleic Acids Research 16:10881,1988；以及Pearson及Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444,1988中。Altschul等人,Nature Genet. 6:119,1994提出序列比對方法及同源性計算的詳細事項。NCBI鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403,1990)自包括美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI,Bethesda,MD)及網際網路之若干來源獲得，以供與序列分析程式blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx聯合使用。如何使用此程式測定序列一致性的描述可在網際網路上的NCBI網站獲得。
兩個核酸之間序列相似性之另一標誌為雜交能力。兩個核酸之序列越相似，其將雜交之條件越嚴格。雜交條件之嚴格性與序列有關且在不同環境參數下不同。因此，得到特定嚴格性程度之雜交條件將視所選雜交方法的種類及雜交核酸序列之組成及長度而變化。一般而言，雜交溫度及雜交緩衝液之離子強度(尤其Na⁺及/或Mg⁺⁺濃度)將決定雜交嚴格性，但洗滌時間亦影響嚴格性。一般而言，選擇比熱力學熔點(T_m)低約5℃至20℃的嚴格條件用於在限定離子強度及pH值下的特定序列。T_m為50%目標序列與完全匹配探針雜交的溫度(在限定離子強度及pH值下)。核酸雜交及嚴格性計算之條件可見於例如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001；Tijssen,Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Ltd.,NY,NY,1993.及Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第4版,John Wiley & Sons,Inc.,1999中。
對於本發明，「嚴格條件」涵蓋僅當雜交分子與目標序列之間的錯配少於25%時才發生雜交的條件。「嚴格條件」可分解為針對更精確定義之特定嚴格程度。因此，如本文所用，「適度嚴格性」條件為不超過25%序列錯配之分子將不會雜交的條件；「中等嚴格性」條件為不超過15%錯配之分子將不會雜交的條件；且「高嚴格性」條件為超過10%錯配之序列將不會雜交的條件。「極高嚴格性」條件為超過6%錯配之序列將不會雜交的條件。相比之下，在「低嚴格性」條件下雜交之核酸包括序列一致性低得多或序列一致性僅超過核酸之短子序列的核酸。因此，應瞭解，本發明涵蓋之核酸的多個變異體能夠與SEQ ID NO: 6、7、8、9、11、13、15及17中之至少一者在實質上其整個長度上雜交。
使用良好確立之程序製造本文揭示之CMV gB多肽以供表現及純化重組蛋白質。足以指導熟習此項技術者之程序可見於例如上文引用之Sambrook及Ausubel參考文獻中。下文提供其他及特定細節。編碼CMV gB多肽之重組核酸(諸如(但不限於)由SEQ ID NO: 6、7、8、9、11、13、15及17表示之例示性核酸)視載體及宿主細胞之選擇而定藉由多種以下熟知程序中之任一者引入宿主細胞中，諸如電穿孔、脂質體介導之轉染、磷酸鈣沈澱、感染、轉染及其類似程序。包括編碼重組CMV gB多肽之核酸的宿主細胞因此亦為本發明之一特徵。有利宿主細胞包括原核(亦即細菌)宿主細胞，諸如大腸桿菌；以及眾多真核宿主細胞，包括真菌(例如酵母，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及甲醇酵母(Picchia pastoris))細胞、昆蟲細胞、植物細胞及哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)。重組CMV gB核酸例如經由載體(諸如表現載體)引入(例如轉導、轉型或轉染)至宿主細胞中。如上文所述，載體最通常為質體，但該等載體亦可為例如病毒粒子、噬菌體等。適當表現宿主之實例包括：細菌細胞，諸如大腸桿菌、鏈黴菌(Streptomyces)及鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)；真菌細胞，諸如釀酒酵母、甲醇酵母及粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa)；昆蟲細胞，諸如果蠅(Drosophila)及草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)；哺乳動物細胞，諸如3T3、COS、CHO、BHK、HEK 293或黑色素瘤(Bowes melanoma)；植物細胞，包括海藻細胞等。
宿主細胞可在適於活化啟動子、選擇轉型體或擴增所插入聚核苷酸序列的經改質習知營養培養基中培養。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)通常為先前與選擇用於表現之宿主細胞一起使用的條件，且將為熟習此項技術者顯而易知，且在本文引用之參考文獻中，包括例如Freshney(1994) Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley-Liss,New York及其中引用之參考文獻。對應於本發明核酸之表現產物亦可在諸如植物、酵母、真菌、細菌及其類似物之非動物細胞中產生。除了Sambrook、Berger及Ausubel之外，關於細胞培養物之細節可見於Payne等人,(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons,Inc. New York,NY；Gamborg及Phillips(編)(1995) Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas及Parks(編)The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press,Boca Raton,FL中。在細菌系統中，可視所表現產物之預期用途而定選擇許多表現載體。舉例而言，當需要大量多肽或其片段來製造抗體時，宜採用指導容易純化之蛋白質的高表現程度的載體。該等載體包括(但不限於)多功能大腸桿菌選殖及表現載體，諸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中所關注編碼序列(例如如上文所述之本發明聚核苷酸)可與胺基端轉譯起始甲硫胺酸之序列及隨後7個產生催化活性β半乳糖酶融合蛋白之β-半乳糖酶殘基同框接合至載體中；pIN載體(Van Heeke及Schuster(1989) J Biol Chem 264:5503-5509)；pET載體(Novagen,Madison WI)，其中胺基端甲硫胺酸與組胺酸標籤同框接合；及其類似載體。類似地，在諸如釀酒酵母之酵母中，含有組成性或誘導性啟動子(諸如α因子、醇氧化酶及PGH)之許多載體可用於產生所要表現產物。關於綜述請參看Berger、Ausubel及例如Grant等人(1987；Methods in Enzymology 153:516-544)。在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多表現系統，包括質體及基於病毒之系統。
針對以所要方式調節插入序列之表現或加工所表現蛋白質的能力視情況選擇宿主細胞。蛋白質之該等修飾包括(但不限於)糖基化(以及例如乙醯化、羧基化、磷酸化、脂化及醯化)。視情況在宿主細胞之情形中進行例如將前驅物形式裂解成成熟形式之蛋白質(例如藉由furin蛋白酶)的轉譯後加工。不同宿主細胞(諸如3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等)具有針對該等轉譯後活性之特定細胞機構及特徵性機制，且可經選擇以確保正確修飾及加工所引入之外來蛋白質。為了長期高產量地製造由本文揭示之核酸編碼之重組CMV gB多肽，通常使用穩定表現系統。舉例而言，藉由向宿主細胞中引入含有病毒複製起點或內源表現元件及可選標記基因之表現載體獲得穩定表現本發明之CMV gB多肽的細胞株。在引入載體後，使細胞在增濃培養基中生長1-2天，隨後更換成選擇性培養基。可選標記之目的係為了賦予選擇抗性，且其存在允許生長及回收成功表現所引入序列的細胞。舉例而言，可使用適用於細胞類型之組織培養技術增殖穩定轉型細胞之抗性群組或純系。以編碼CMV gB多肽之核酸轉型的宿主細胞視情況在適於表現及自細胞培養物回收所編碼蛋白質的條件下培養。
在轉導適合宿主細胞株及宿主細胞生長至適當細胞密度後，藉由適當方式(例如溫度移位或化學誘導)誘導所選啟動子且再培養細胞一段時間。分泌之多肽產物接著自培養基回收且純化。或者，細胞可藉由離心收集，藉由物理或化學方式破碎，且保留所得粗提取物以供進一步純化。用於表現蛋白質之真核或微生物細胞可藉由任何習知方法破碎，包括凍融循環、音波處理、機械破碎，或使用可藉由此項技術中熟知之許多方法中之任一者自重組細胞培養物回收及純化的細胞CMV gB多肽，包括硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性相互作用層析法、親和力層析法(例如使用本文所述之任一標籤系統)、羥基磷灰石層析法及外源凝集素層析法。蛋白質再摺疊步驟可視需要用於實現成熟蛋白質之組態。最終，高效液相層析(HPLC)可用於最終純化步驟中。除了上文所述之參考文獻之外，此項技術中熟知多種純化方法，包括例如Sandana(1997) Bioseparation of Proteins,Academic Press,Inc.；及Bollag等人,(1996) Protein Methods,第2版Wiley-Liss,NY；Walker(1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ,Harris及Angal(1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,U.K.；Scopes(1993) Protein Purification: Principles and Practice第3版Springer Verlag,NY；Janson及Ryden(1998) Protein Purification: Principles,High Resolution Methods and Applications,第2版Wiley-VCH,NY；及Walker(1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ中所述者。
在一實例中，編碼CMV gB多肽之聚核苷酸選殖至適於引入至哺乳動物細胞(例如CHO細胞)中的載體中。在此例示性實施例中，編碼CMV gB多肽之聚核苷酸序列引入至由Amaxa研發之pMax載體中。多肽在組成性啟動子(即刻早期CMV啟動子)下表現。基於轉染細胞在康黴素存在下生長之能力選擇表現嵌合體之穩定轉染細胞。成功整合pMax之細胞能夠在康黴素存在下生長，這是因為pMax載體表現康黴素耐藥性基因。所選細胞可無性擴增及經表徵以用於表現CMV gB多肽。或者，編碼本發明CMV gB多肽之聚核苷酸序列可引入至由NRC開發之pTT5載體中，其表現安比西林耐藥性基因。
在轉染及誘導表現(根據所選啟動子及/或強化子或其他調節元件)後，回收(例如純化或增濃)所表現多肽。以下為用於純化CMV gB多肽之例示性程序。為了促進純化，CMV gB多肽包括C端聚組胺酸標籤。簡言之，轉染6天後收集細胞培養物上清液。澄清後，將上清液裝載至鎳管柱上。
術語「純化」係指自組合物移除組分之過程，該等組分無需存在。純化為相對術語，且無需自組合物移除非所要組分之所有痕量。在疫苗製造情況中，純化包括諸如離心、透析、離子交換層析法及尺寸排阻層析法、親和力純化或沈澱之製程。因此，術語「經純化」無需絕對純淨；而是意欲作為相對術語。實質上純核酸或蛋白質之製劑可經純化，使得所要核酸或蛋白質佔製劑的總核酸含量之至少50%。在某些實施例中，實質上純核酸或蛋白質將佔製劑之總核酸或蛋白質含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或95%以上。
在本發明之意義上，「經分離」生物組分(諸如核酸分子或蛋白質)已實質上分離或純化以不含天然存在其他生物組分之生物體細胞中的該等組分，諸如其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質及細胞器。已「分離」之核酸及蛋白質包括藉由標準純化方法純化之核酸及蛋白質。術語亦涵蓋藉由在宿主細胞中重組表現製備之核酸及蛋白質以及化學合成之核酸及蛋白質。
本發明之CMV gB多肽及核酸適用於製備用於治療CMV感染之藥物。本發明之CMV gB多肽尤其適用作供納入免疫原性組合物(諸如疫苗)中之抗原。因此，本發明亦涵蓋藉由向個體投與免疫有效量之含有任何本發明CMV gB多肽之組合物引起針對CMV之免疫反應的方法。個體可為HCMV血清陽性或HCMV血清陰性個體。在一些實施例中，個體為青春期少女，年齡通常為12歲至16歲。或者，個體為育齡期婦女。通常，育齡期婦女之群組表示16歲至45歲的可懷孕婦女。在一特定實施例中，本發明涵蓋引起針對CMV之免疫反應之方法，其包含向HCMV血清陰性育齡期婦女投與免疫有效量之包含本發明gB多肽之組合物的步驟。在一替代實施例中，本發明之CMV gB多肽用於製備用以預防及/或治療CMV感染之藥物。適合地，組合物或藥物引起會減輕或預防CMV感染及/或減輕或預防CMV感染後的病理學反應的保護性免疫反應。詳言之，向育齡期婦女投與免疫有效量之含有任何本發明CMV gB多肽之組合物的本發明方法預防CMV自母親向胎兒傳播，亦即預防CMV先天性感染。術語「預防新生兒HCMV先天性感染」意謂新生兒在出生時無HCMV感染。或者，接收本發明之免疫原性組合物的適合個體為免疫功能不全個體，諸如移植手術患者。因此，在一些實施例中，本發明涵蓋本發明之CMV gB多肽減輕及/或預防免疫功能不全個體的CMV感染之用途。在其他實施例中，本發明涵蓋引起針對CMV之免疫反應的方法，其包含向免疫功能不全個體投與本發明之CMV gB多肽的步驟。
「個體」為活的多細胞脊椎動物生物體。在本發明中，個體可為實驗個體，諸如非人類動物，例如小鼠、棉鼠或非人類靈長類動物。或者，如上文所指示，個體可為人類個體。
「抗原」為可藉由在動物中產生抗體及/或T細胞反應刺激免疫反應的化合物、組合物或物質，包括注射、吸收或引入動物中之組合物。術語「抗原」包括所有相關抗原決定基。術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指抗原上與B及/或T細胞反應之位點。「主要抗原決定基」為進行功能顯著宿主免疫反應(例如抗體反應或T細胞反應)的抗原決定基。因此，關於針對病原體之保護性免疫反應，主要抗原決定基為當被宿主免疫系統識別時產生對由該病原體引起之疾病之保護的抗原部分。術語「T細胞抗原決定基」係指當結合於適當MHC分子時由T細胞(經T細胞受體)特異性結合之抗原決定基。「B細胞抗原決定基」為由抗體(或B細胞受體分子)特異性結合之抗原決定基。
「免疫反應」為免疫系統之細胞(諸如B細胞、T細胞或單核細胞)對刺激之反應。免疫反應可為導致產生特異性抗體，諸如抗原特異性中和抗體之B細胞反應。免疫反應亦可為T細胞反應，諸如CD4+反應或CD8+反應。在一些情形中，反應對特定抗原，尤其CMV有特異性(亦即「抗原特異性反應」)。若抗原源自病原體，則抗原特異性反應為「病原體特異性反應」。「保護性免疫反應」為抑制病原體之有害功能或活性、減輕病原體感染或減少由病原體感染引起之症狀(包括死亡)的免疫反應。保護性免疫反應可例如藉由在斑塊形成減少檢定或ELISA中和檢定中抑制病毒複製或斑塊形成或藉由量測對活體內病原體攻毒之抗性來量測。
通常，免疫反應引起特徵為產生Th1型細胞激素的免疫反應，例如Th1型免疫反應。「Th1」型免疫反應之特徵為產生IL-2及IFN-γ之CD4+ T輔助細胞。相比之下，「Th2」型免疫反應之特徵為產生IL-4、IL-5及IL-13之CD4+輔助細胞。
「免疫有效量」為用於在個體中引起免疫反應之組合物(通常免疫原性組合物)的量。通常，所要結果為產生能夠或促成針對病原體(諸如CMV)保護個體的抗原(例如病原體)特異性免疫反應。然而，為了獲得針對病原體之保護性免疫反應，可能需要多次投與免疫原性組合物。因此，在本發明之情形中，術語免疫有效量涵蓋與先前或隨後投藥組合以獲得保護性免疫反應之分次劑量。
亦提供包括CMV gB多肽及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的免疫原性組合物，諸如疫苗。「免疫原性組合物」為適於向人類或動物個體投與的相關組合物，其能夠引起例如針對病原體(諸如CMV)之特異性免疫反應。因此，免疫原性組合物包括一或多種抗原(例如多肽抗原)或抗原決定基，諸如本發明之CMV gB多肽。免疫原性組合物亦可包括一或多種能夠引起或提高免疫反應的其他組分，諸如賦形劑、載劑及/或佐劑。在某些情形中，投與免疫原性組合物以引起針對病原體所誘導之症狀或病況保護個體的免疫反應。在一些情形中，藉由在個體暴露於病原體(例如CMV)之後抑制病原體複製來預防(或減輕或改善)由病原體引起之症狀或疾病。在本發明之情形中，術語免疫原性組合物應理解為涵蓋意欲為引起針對CMV之保護性或緩解性免疫反應之目的向個體或個體群體投與之組合物(亦即疫苗組合物或疫苗)。本發明之免疫原性組合物不限於包含CMV gB多肽之組合物。本發明亦涵蓋免疫原性組合物(諸如疫苗)，其包含本發明之CMV gB多肽及至少一或多種選自由以下組成之群的CMV抗原：pp65、IE1、pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130或其任何組合。本發明亦涵蓋免疫原性組合物(諸如疫苗)，其包含本發明之CMV gB多肽及至少一或多種選自由以下組成之群的CMV抗原：HPV、披衣菌(Chlamydia)、RSV、弓蟲(Toxoplasma gondii)、帶狀疱疹(Zoster)及麴菌(Aspergillus)。
眾多醫藥學上可接受之稀釋劑及載劑及/或醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中已知且描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences,E. W. Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)中。形容詞「醫藥學上可接受」指示稀釋劑、或載劑、或賦形劑適於向個體(例如人類或動物個體)投與。一般而言，稀釋劑、載劑及/或賦形劑之種類將視所採用之特定投藥模式而定。舉例而言，非經腸調配物一般包括可注射流體作為媒劑，包括醫藥學及生理學上可接受之流體，諸如水、生理食鹽水、平衡鹽溶液、右旋糖水溶液、甘油或其類似物。在某些調配物(例如固體組合物，諸如粉末形式)中，不採用液體稀釋劑。在該等調配物中，可使用無毒固體載劑，包括例如醫藥級海藻糖、甘露糖醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。
因此，熟習此項技術者可選擇適合賦形劑及載劑來製造適於藉由所選投藥途徑向個體傳遞之調配物。賦形劑包括(但不限於)：甘油、聚乙二醇(PEG)、形成玻璃之多元醇(諸如山梨糖醇、海藻糖)N-月桂醯基肌胺酸(例如鈉鹽)、L-脯胺酸、非清潔劑磺基甜菜鹼、胍鹽酸鹽、脲、氧化三甲胺、KCl、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺(及其他二價陽離子相關鹽)、二硫蘇糖醇(DTT)、硫代赤藻糖醇、β-巰基乙醇、清潔劑(包括例如Tween80、Tween20、Triton X-100、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂醯基麥芽糖苷、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12、Zwittergent 3-14、Zwittergent 3-16、CHAPS、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉及溴化鯨蠟基三甲基銨。
在某些實例中，免疫原性組合物亦包括佐劑。用於含有本發明之CMV gB多肽之免疫原性組合物中的適合佐劑為與本文揭示之該等多肽組合的佐劑，其當向個體投與時安全且反應原性最低。
「佐劑」為以非特異性方式增加免疫反應產生之試劑。常見佐劑包括吸附抗原之礦物懸浮液(明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁)；乳液，包括油包水及水包油(及其變異體，包括雙乳液及可逆乳液)、脂醣、脂多醣、免疫刺激性核酸(諸如CpG寡核苷酸)、脂質體、Toll受體促效劑(尤其TLR2、TLR4、TLR7/8及TLR9促效劑)及該等組分之多種組合。
與本發明之CMV gB多肽組合使用之適合佐劑為皂素。因此，本發明之免疫原性組合物可包含皂素QS21(WO 8809336A1；US 5057540A)。QS21在此項技術中熟知為源自石鹼木(Quillaja saponaria Molina)之莖皮的天然皂素，其誘導CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、Th1細胞及主要IgG2a抗體反應。為了避免疑問，QS21包括OPT-821。在本發明之適合形式時，本發明之免疫原性組合物包含實質上純形式之QS21，亦即QS21為至少80%、至少85%、至少90%純，例如至少95%純或至少98%純。本發明之組合物可包含約1 μg至約100 μg，例如約1 μg至約60 μg或10 μg至約50 μg，例如約10 μg、約12.5 μg、約15 μg、約20 μg、約25 μg、約30 μg、約40 μg或尤其約50 μg之量的QS21。特定言之，QS21以約40 μg至60 μg、或45 μg至55 μg、或47 μg至53 μg、或48 μg至52 μg、或49 μg至51 μg、或約50 μg之量存在。或者，QS21以21 μg至29 μg，或約22 μg至約28 μg、或約23 μg至約27 μg、或約24 μg至約26 μg、或約25 μg之量存在。在一些實施例中，包含本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物包含約10 μg，例如約5 μg至15 μg、約6 μg至約14 μg、約7 μg至約13 μg、約8 μg至約12 μg或約9 μg至約11 μg、或約10 μg之量的QS21。在另一實施例中，本發明之免疫原性組合物包含約5 μg，例如約1 μg至9 μg、約2 μg至約8 μg、約3 μg至約7 μg、約4 μg至約6 μg或約5 μg之量的QS21。本發明組合物之人類劑量中QS21的適合量為例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg中之任一者。
包含本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物可包含QS21及固醇，詳言之膽固醇。該等組合物當與無固醇存在而保持佐劑作用之組合物比較時顯示降低之反應原性。可根據WO 96/33739中揭示之方法評定反應原性研究。本發明之固醇意謂外源性固醇，亦即並非可獲得β-類澱粉抗原製劑之生物體內源性固醇。適合地，如WO 96/33739中所述，外源固醇與皂素佐劑締合。在一特定實施例中，膽固醇過量於QS21存在，例如QS21：固醇之比率通常將為1:100至1:1(w/w)、適合地1:10至1:1(w/w)及較佳1:5至1:1(w/w)的數量級。特定言之，QS21：固醇之比率為至少1:2(w/w)。在一特定實施例中，QS21：固醇之比率為1:5(w/w)。適合固醇包括β-植物固醇、豆固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇及膽固醇。在一特定實施例中，本發明組合物包含膽固醇作為固醇。此等固醇為此項技術中所熟知，例如膽固醇揭示於Merck Index,第11版，第341頁中，為動物脂肪中發現的天然存在之固醇。因此，在一特定實施例中，包含本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物包含QS21之較低反應原性組合物，其中其以外源性固醇，諸如膽固醇淬滅。存在若干特定形式之較低反應原性組合物，其中QS21以外源性膽固醇淬滅。在一特定實施例中，皂素/固醇呈脂質體結構形式(WO 96/337391)。因此，舉例而言，本發明之CMV gB多肽可適合地與包含QS21與膽固醇之組合的佐劑一起用於免疫原性組合物中。
術語「脂質體」一般係指囊封水性內部之單層或多層(尤其視形成之脂質膜數目而定為2、3、4、5、6、7、8、9或10層)脂質結構。此項技術中熟知脂質體及脂質體調配物。能夠形成脂質體之脂質包括具有脂肪或脂肪樣特性之所有物質。可構成脂質體中之脂質的脂質可選自包含以下之群：甘油酯、甘油磷脂、甘油膦脂、甘油磷醯脂、硫脂質、鞘脂、磷脂、異戊二烯酸內酯(isopreno-lides)、類固醇、硬脂、固醇、原始脂質、合成陽離子性脂質及含碳水化合物之脂質。脂質體可適合地包含磷脂。適合磷脂包括(但不限於)：磷酸膽鹼(PC)，其為磷脂醯膽鹼合成中之中間物；天然磷脂衍生物：卵磷酸膽鹼、卵磷酸膽鹼、大豆磷酸膽鹼、氫化大豆磷酸膽鹼、天然磷脂形式之鞘磷脂；及合成磷脂衍生物：磷酸膽鹼(二癸醯基-L-α-磷脂醯膽鹼[DDPC]、二月桂醯基磷脂醯膽鹼[DLPC]、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼[DMPC]、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼[DPPC]、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼[DSPC]、二油醯基磷脂醯膽鹼[DOPC]、1-軟脂醯基、2-油醯基磷脂醯膽鹼[POPC]、二反油醯基磷脂醯膽鹼[DEPC])、磷酸甘油(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二軟脂醯基磷脂酸[DPPA]、二硬脂醯基-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷絲胺酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚丙三醇-磷脂、官能化磷脂、末端活化之磷脂)。在一實施例中，脂質體包含1-軟脂醯基-2-油醯基-甘油-3-磷酸乙醇胺。在一實施例中，使用高度純化之磷脂醯膽鹼且可選自包含以下之群：磷脂醯膽鹼(EGG)、氫化磷脂醯膽鹼(EGG)磷脂醯膽鹼(SOY)氫化磷脂醯膽鹼(SOY)。在另一實施例中，脂質體包含磷脂醯乙醇胺[POPE]或其衍生物。視磷脂組合物及其製備方法而定，脂質體尺寸可在30 nm與數微米之間變化。在本發明之特定實施例中，脂質體尺寸將在50 nm至500 nm範圍中，且在其他實施例中，為50 nm至200 nm。動態雷射光散射為熟習此項技術者熟知的用於量測脂質體尺寸之方法。本發明之脂質體可包含二油醯基磷脂醯膽鹼[DOPC]及固醇，詳言之膽固醇。因此，在一特定實施例中，包含本發明CMV gB多肽(諸如具有非功能跨膜結構域及突變融合環FL1及FL2中之至少一者、有可能其兩者的gB多肽)之免疫原性組合物包含本文所述之任何量的脂質體形式之QS21，其中該脂質體包含二油醯基磷脂醯膽鹼[DOPC]及固醇，詳言之膽固醇。
本發明之免疫原性組合物可包含一或多種其他免疫刺激劑。在一實施例中，如本文所述之包含本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物另外包含脂多醣，適合地脂質A之無毒衍生物，尤其單磷醯基脂質A或更特定言之3-去醯單磷醯基脂質A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以名稱MPL出售，且在說明書全文中稱為MPL或3D-MPL。參看例如美國專利第4,436,727號；第4,877,611號；第4,866,034號及第4,912,094號。3D-MPL主要與IFN-γ(Th1)表型一起促進CD4+ T細胞反應。可根據GB2220211 A中揭示之方法製造3D-MPL。在化學性質上，其為具有3、4、5或6個醯化鏈之3-去醯單磷醯基脂質A的混合物。在本發明組合物中，可使用小粒子3D-MPL。小粒子3D-MPL的粒度使其可經0.22 μm過濾器無菌過濾。該製劑描述於WO 94/21292中。
本發明之組合物可包含約1 μg至約100 μg，例如約1 μg至約60 μg或10 μg至約50 μg，例如約10 μg、約12.5 μg、約15 μg、約20 μg、約25 μg、約30 μg、約40 μg或尤其約50 μg之量的3D-MPL。特定言之，3D-MPL以約40 μg至60 μg、或45 μg至55 μg、或47 μg至53 μg、或48 μg至52 μg、或49 μg至51 μg、或約50 μg之量存在。或者，3D-MPL以21 μg至29 μg，或約22 μg至約28 μg、或約23 μg至約27 μg、或約24 μg至約26 μg、或約25 μg之量存在。
在另一實施例中，免疫原性組合物之人類劑量包含約10 μg，例如5 μg至15 μg，適合地6 μg至14 μg，例如7 μg至13 μg、或8 μg至12 μg、或9 μg至11 μg、或10 μg之含量的3D-MPL。在另一實施例中，免疫原性組合物之人類劑量包含約5 μg，例如1 μg至9 μg、或2 μg至8 μg、或適合地3 μg至7 μg、或4 μg至6 μg、或5 μg之含量的3D-MPL。3D-MPL在本發明組合物中的適合量為例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg中之任一者。在其他實施例中，脂多醣可為美國專利第6,005,099號及歐洲專利第0 729 473 B1號所述之β1-6)葡糖胺雙醣。熟習此項技術者將能夠容易地基於此等參考文獻之教示製造多種脂多醣，諸如3D-MPL。除上述免疫刺激劑(其結構與LPS或MPL或3D-MPL類似)之外，為上述MPL結構之子部分的醯化單醣及雙醣衍生物亦為適合佐劑。在其他實施例中，佐劑為脂質A之合成衍生物，其中一些描述為TLR-4促效劑，且包括(但不限於)：
OM174(2-去氧-6-o-[2-去氧-2-[(R)-3-十二醯氧基十四醯基胺基]-4-o-磷酸基-β-D-葡萄哌喃糖基]-2-[(R)-3-羥基十四醯基胺基]-β-D-葡萄哌喃糖基二氫磷酸酯)，(WO 95/14026)
OM 294 DP(3S,9R)-3--[(R)-十二醯氧基十四醯基胺基]-4-側氧基-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四醯基胺基]癸-1,10-二醇,1,10-雙(二氫磷酸酯)(WO 99/64301及WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP(3S-,9R)-3-[(R)-十二醯氧基十四醯基胺基]-4-側氧基-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四醯基胺基]癸-1,10-二醇,1-二氫磷酸酯10-(6-胺基己酸酯)(WO 01/46127)
不同佐劑(諸如上文所述者)之組合亦可與CMV gB多肽一起用於組合物中。舉例而言，如已指出，QS21可與3D-MPL一起調配。QS21:3D-MPL之比率通常將為1:10至10:1；諸如1:5至5:1，且通常實質上為1:1的數量級。通常，比率在2.5:1至1:13 D-MPL:QS21之範圍內。因此，在一些實施例中，包含本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物至少包含QS21及3D-MPL。
包含本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物亦可與水包油乳液一起適合地調配。水包油乳液包含可代謝油(亦即生物可分解)。油可為任何植物油、魚油、動物油或合成油，其對接受者無毒且能夠藉由代謝轉化。堅果、種子及穀粒為常見的植物油來源。合成油亦適合。因此，與本發明之CMV gB多肽組合使用之水包油乳液包含可代謝油。在一特定實施例中，水包油乳液包含鯊烯(例如約4%至6%[v/v])。水包油乳液可進一步包含界面活性劑。本發明之水包油包含一或多種界面活性劑。適合界面活性劑為熟習此項技術者所熟知且包括(但不限於)聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80、聚山梨醇酯80)、脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)十六基十八基醚及辛苯聚醇-9(Triton X-100)。在本發明之一特定實施例中，水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80、聚山梨醇酯80)。在另一實施例中，本發明之水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80)及另一界面活性劑，特定言之脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)。本發明之水包油乳液亦可包含母育酚(tocol)。母育酚在此項技術中為熟知的且描述於EP 0382271中。特定言之，母育酚為α-生育酚或其衍生物，諸如α-生育酚丁二酸酯(亦稱為維生素E丁二酸酯)。在本發明之一特定實施例中，提供包含本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物與包含鯊烯(例如約5%[v/v])及α-生育酚(例如約5%[v/v])之水包油乳液的組合。在一特定實施例中，水包油乳液包含可代謝油(例如鯊烯)、母育酚(例如α-生育酚)及界面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨醇酯80])。在本發明之另一實施例中，本發明之水包油乳液包含可代謝油(例如鯊烯)、界面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨醇酯80])及視情況選用之第二界面活性劑(例如脫水山梨糖醇三油酸酯[Span 85])。在本發明之另一實施例中，本發明之水包油乳液包含可代謝油(例如鯊烯)、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子性界面活性劑(例如聚氧乙烯(12)十六基十八基醚)及疏水性非離子性界面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨醇酯80]或脫水山梨糖醇三油酸酯[Span 85])。在一些實施例中，包含本發明CMV gB多肽(諸如具有非功能跨膜結構域及突變融合環FL1及FL2中之至少一者、有可能其兩者之gB多肽)之免疫原性組合物包含具有鯊烯、α-生育酚及聚山梨醇酯80之水包油乳液。
適合地，水包油包含每劑量疫苗11 mg或11 mg以下(例如0.5-11 mg、0.5-10 mg或0.5-9 mg、1-10 mg、1-11 mg、2-10 mg、4-8 mg或4.5-5.5 mg)可代謝油(諸如鯊烯)，及5 mg或5 mg以下(例如0.1-5 mg、0.2-5 mg、0.3-5 mg、0.4-5 mg、0.5-4 mg、1-2 mg或2-3 mg)乳化劑(諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。母育酚(例如α-生育酚)適合地每人類疫苗劑量存在12 mg或12 mg以下，例如0.5-12 mg、10-11 mg、1-11 mg、2-10 mg、4-9 mg或5-7 mg。
術語「疫苗人類劑量」意謂適於人類使用之體積的劑量。一般而言，為0.25至1.5 ml。在一實施例中，人類劑量為0.5 ml。在另一實施例中，人類劑量大於0.5 ml，例如為0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在另一實施例中，人類劑量為1 ml至1.5 ml。在另一實施例中，尤其當免疫原性組合物用於兒科群體時，人類劑量可小於0.5 ml，諸如為0.25至0.5 ml。
免疫原性組合物通常含有免疫保護量(或其分劑量)之抗原且可藉由習知技術製備。免疫原性組合物(諸如疫苗)，包括用於向人類個體投與之組合物的製備一般描述於Pharmaceutical Biotechnology,第61卷Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach,Powell及Newman編,Plenurn Press,1995. New Trends and Developments in Vaccines,Voller等人編,University Park Press,Baltimore,Maryland,U.S.A. 1978中。脂質體內之囊封由例如Fullerton，美國專利4,235,877描述。蛋白質與大分子之結合由例如Likhite，美國專利4,372,945及Armor等人，美國專利4,474,757揭示。通常，選擇蛋白質於各劑量免疫原性組合物中之量作為在典型個體中誘發免疫保護性反應而無顯著不良副作用的量。此情形中之免疫保護性不必意謂針對感染之完全保護；其意謂針對與病毒有關之症狀或疾病，尤其嚴重疾病的保護。抗原之量可視採用之特異性免疫原而變化。一般而言，預期各人類劑量將包含1-1000 μg蛋白質，諸如約1 μg至約100 μg，例如約1 μg至約50 μg，諸如約1 μg、約2 μg、約5 μg、約10 μg、約15 μg、約20 μg、約25 μg、約30 μg、約40 μg或約50 μg。免疫原性組合物中所用之量基於個體群體(例如嬰兒或老年人)來選擇。可藉由涉及觀測抗體效價及個體中之其他反應的標準研究確定特定組合物之最佳量。在初始接種後，個體可在約4週內接收增強免疫。
除非另外解釋，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。分子生物學中常見術語之定義可見於Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd出版；1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A. Meyers(編),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)中。
除非上下文另外明確指出，否則單數術語「一」及「該」包括複數個提及物。應進一步理解，針對核酸或多肽給出之所有鹼基尺寸或胺基酸尺寸及所有分子量或分子質量值為約數且為描述目的而提供。術語「複數個」係指兩個或兩個以上。應進一步理解，針對核酸或多肽給出之所有鹼基尺寸或胺基酸尺寸及所有分子量或分子質量值為約數且為描述目的而提供。此外，關於物質(諸如抗原)之濃度或含量給出之數量限值意欲為約數。因此，若指出濃度為至少(例如)200 pg，則預期濃度應理解為至少約(或「~」)200 pg。
儘管與本文所述之彼等類似或相等之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文描述適合方法及材料。術語「包含」意謂「包括」。因此，除非上下文另外要求，否則「包含」一詞及其變化形式應理解為暗示包括所述化合物或組合物(例如核酸、多肽、抗原)或步驟、或化合物或步驟之群，但不排除任何其他化合物、組合物、步驟或其群。縮寫「例如(e.g.)」源自拉丁語例如(exempli gratia)，且在本文中用於指示非限制性實例。因此，縮寫「例如(e.g.)」與術語「舉例而言(for example)」同義。
本發明涵蓋以下實施例：
a)　一種巨細胞病毒(CMV)gB多肽，其在N端至C端方向上包含：包含融合環1(FL1)結構域及融合環2(FL2)結構域之胞外域的至少一部分，視情況存在之跨膜(TM)結構域的至少一部分及細胞質域的至少一部分，其中FL1結構域之至少一個胺基酸經取代或缺失，且其中TM結構域或其部分當存在時為非功能結構域。
b)　實施例a)之CMV gB多肽，其中TM結構域藉由缺失SEQ ID NO:1中所述序列之位置701-775或其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸而變成非功能性的。
c)　實施例a)或b)之CMV gB多肽在融合環FL2結構域中進一步包含至少一個胺基酸取代或缺失。
d)　實施例a)至c)中任一者之CMV gB多肽在多肽之細胞質域中進一步包含至少一個疏水性胺基酸區域之缺失。
e)　實施例a)至d)中任一者之CMV gB多肽，其中融合環FL1結構域中的一個胺基酸取代係位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置155-157處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的Y.I.Y中至少一個胺基酸經不為芳族之極性胺基酸取代。
f)　實施例e)之CMV gB多肽，其中該取代係位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置155-157處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的Y.I.Y中至少兩個胺基酸經不為芳族之極性胺基酸取代。
g)　實施例e)或f)之CMV gB多肽，其中極性胺基酸係選自由離胺酸(K)、組胺酸(H)及精胺酸(R)組成之帶正電胺基酸之群。
h)　實施例g)之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置156處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的異白胺酸(I)經組胺酸(H)取代。
i)　實施例g)或實施例h)之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置157處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的酪胺酸(Y)經精胺酸(R)取代。
j)　實施例e)至i)中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置155處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的酪胺酸(Y)經甘胺酸(G)取代。
k)　實施例a)至d)中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之融合環FL1結構域之位置155-157處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸Y.I.Y分別經胺基酸G.H.R取代。
l)　實施例a)至d)中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之融合環FL1結構域中的位置155-157處或其他CMV gB多肽中之相應位置處且如凱特及杜立德量表所量測疏水性評分為+1.9的胺基酸Y.I.Y之段經如凱特及杜立德量表所量測疏水性評分小於-3、小於-7、小於-8之三個胺基酸的段取代。
m)　實施例c)至1)中任一項之CMV gB多肽，其中融合環FL2結構域中的胺基酸取代係位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置240-242處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的W.L.Y中之至少一個胺基酸經選自由離胺酸(K)、組胺酸(H)及精胺酸(R)組成之群的帶正電胺基酸取代。
n)　實施例m)之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置240-242處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的W.L.Y中之胺基酸經組胺酸(H)取代。
o)　實施例m)或n)之CMV gB多肽，其中至少位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置242處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的酪胺酸(Y)經組胺酸(H)取代。
p)　實施例c)至n)中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之融合環FL2結構域的位置240-242處或其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸W.L.Y分別經胺基酸A.F.H取代。
q)　實施例d)至p)中任一項之CMV gB多肽，其中細胞質域中之缺失對應於SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸825至877的區域。
r)　實施例a)至q)中任一項之CMV gB多肽，其中該多肽在內源性蛋白分解位點處突變。
s)　實施例r)之CMV gB多肽，其中進行至少一個選自由以下組成之群的胺基酸取代：SEQ ID NO:1中所述序列或其他CMV gB多肽中之相應位置處以T⁴⁵⁶取代R⁴⁵⁶、以Q⁴⁵⁸取代R⁴⁵⁸及以T⁴⁵⁹取代R⁴⁵⁹。
t)　實施例s)之CMV gB多肽，其中SEQ ID NO:1中所述序列或其他CMV gB多肽中之相應位置處的胺基酸R⁴⁵⁶、R⁴⁵⁸及R⁴⁵⁹分別經T⁴⁵⁶、Q⁴⁵⁸及T⁴⁵⁹取代。
u)　實施例a)至t)中任一項之CMV gB多肽，其中SEQ ID NO:1中所述序列之精胺酸(R³⁵⁷)經絲胺酸(S³⁵⁷)取代。
v)　實施例a)至u)中任一項之CMV gB多肽，其中SEQ ID NO:1中所述序列之精胺酸(R⁵⁰)經絲胺酸(S⁵⁰)取代。
w)　實施例a)至v)中任一項之CMV gB多肽，其中SEQ ID NO:1中所述序列之半胱胺酸(C⁷⁷⁸)經丙胺酸(A⁷⁷⁸)取代。
x)　SEQ ID NO:3所述序列之CMV多肽。
y)　SEQ ID NO:4所述序列之CMV多肽。
z)　SEQ ID NO:5所述序列之CMV多肽。
aa)一種包含CMV gB多肽之製劑，其中如AUC(分析型超離心)所量測超過50%該多肽呈三聚體形式。
bb)一種免疫原性組合物，其包含與適合醫藥載劑混合的實施例a)至z)中任一項之CMV gB多肽。
cc)實施例bb)之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
dd)一種聚核苷酸，其編碼實施例a)-z)中任一項之CMV gB多肽。
ee)一種重組載體，其包含實施例dd)之聚核苷酸。
ff)　一種宿主細胞，其經實施例ee)之重組載體轉型。
gg)實施例a)至z)中任一項之CMV gB多肽，其係用於預防及/或治療CMV感染。
hh)實施例a)至z)中任一項之CMV gB多肽的用途，其係用於製備用以預防及/或治療CMV感染之藥物。
ii)　一種引起針對CMV之免疫反應的方法，其包含向個體投與免疫有效量之包含實施例a)至z)中任一項之CMV gB多肽之組合物的步驟。
本發明將藉由參考以下非限制性實例進一步描述。實例1：CMV gB多肽
下文指定之所有gB多肽變異體(參看圖1及圖2之圖示)均源於來自CMV病毒株AD169之gB的胺基酸序列。因此，規定突變位置之胺基酸編號係相對於SEQ ID NO:1中所述之AD169 CMV gB序列。此外，除了各自含有的特定突變之外，如下文所述，以下構築體(i)均缺失跨膜結構域(缺失胺基酸701至775)且(ii)均包含以下點突變：胺基酸R⁵⁰及R³⁵⁷經胺基酸S取代。
當以下變異體在多肽之C端末端包含組胺酸標籤以供短暫轉染時，該標籤之序列不包括於本文所揭示之SEQ ID中。 1.1 gB-SLP12
gB-SLP12變異體包含分別靶向gB之推定融合環FL1及FL2的2個點突變系列。FL1藉由以胺基酸¹⁵⁵G.H.R¹⁵⁷取代胺基酸¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷發生突變，而FL2藉由以胺基酸²⁴⁰A.F.H²⁴²取代胺基酸²⁴⁰W.L.Y²⁴²發生突變。此構築體編碼830個胺基酸長的蛋白質。gB-SLP12之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:3中給出。 1.1.1　表現載體pMax-AD169-gB-SLP12之建構
gB-SLP12基因序列(SEQ ID NO:6)由GeneArt公司合成。使編碼序列之密碼子最佳化以供在CHO細胞中表現。分別將HindIII及BamHI限制位點引入5'端(在起始密碼子之前)及3'端(緊接終止密碼子之後)。密碼子最佳化基因序列在第一推定融合環(¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷置換為¹⁵⁵G.H.R¹⁵⁷)及第二推定融合環(²⁴⁰W.L.Y²⁴²置換為²⁴⁰A.F.H²⁴²)處皆具有突變。合成DNA片段作為使用KpnI及SacI選殖位點選殖至pMA載體(GeneArt專屬質體)中的2558 bp的長DNA插入物而接收，得到AD169-gB-SLP12-pMA質體。AD169-gB-SLP12-pMA質體以HindIII及BamHI限制。含有gB-SLP12基因之2530 bp DNA片段經凝膠純化且接合至哺乳動物表現載體pMax中，其為Amaxa之pMaxCloning載體的經修飾形式。pMaxCloning載體骨架已經修飾以消除A maXa市售載體之多個選殖位點(KpnI與HindIII之間)中存在的ATG起始密碼子。在藉由自動DNA定序核對序列之後，使用pMax-AD169-gB-SLP12重組質體短暫轉染CHO-S細胞。 1.2 gB-SLP12-Del2
向gB-SLP12變異體中引入一個涵蓋胺基酸Pro⁸²⁵至Lys⁸⁷⁷之疏水性區域的缺失，產生gB-SLP12-Del2變異體。此構築體編碼777個胺基酸長的蛋白質。gB-SLP12-Del2變異體之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:4中給出。編碼gB-SLP12-Del2之核苷酸序列在SEQ ID NO:8中給出。 1.2.1　表現載體pMax-AD169-gB-SLP12-Del2之建構
藉由PCR，使用AD169-gB-SLP12-pMA質體作為模板以及引子SLP-Fw(SEQ ID NO:22)(5'-GAAAGCGGGCAGTGAGCGGAAGGC-3')及SLP-Rv(SEQ ID NO:23)(5'-TGTCCTCCACGTACTTCACGCGCTGC-3')擴增涵蓋AD169-gB-SLP12編碼序列中存在之HindIII及ClaI獨特限制位點的2159 bp之DNA片段。使用Del2-pMA載體作為模板以及引子Del-Fw(SEQ ID NO:24)(5'-CCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCA-3')及Del-Rv(SEQ ID NO:25)(5'-CCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3')，AD169-gB-SLP12Del2基因之C端部分亦PCR擴增成為涵蓋ClaI及SacI限制位點之745 bp片段。具有編碼gB-SLP12-Del2基因之C端部分之合成DNA片段的Del2-pMA載體由GeneArt公司建構。在以適當酶限制之後，PCR片段選殖至以HindIII及SacI限制之pMax載體中。在藉由自動DNA定序核對序列之後，使用pMax-AD169-gB-SLP12重組質體短暫轉染CHO-S細胞。 1.3 gB-SLP1-Del2
向gB-SLP1變異體中引入一個涵蓋胺基酸Pro⁸²⁵至Lys⁸⁷⁷之疏水性區域的缺失，產生gB-SLP1-Del2變異體。此變異體編碼777個胺基酸長的蛋白質。gB-SLP1-Del2變異體之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:5中給出。 1.3.1　表現載體pMax-AD169-gB-SLP1-Del2之建構
gB-SLP1基因由GeneArt首先合成。密碼子最佳化基因序列在第一推定融合環中具有突變(¹⁵⁵Y.I.Y¹⁵⁷置換為¹⁵⁵G.H.R¹⁵⁷)。此合成基因以2558 bp DNA片段形式接收，使用KpnI及SacI選殖位點選殖至pMA載體中，產生AD169-gB-SLP1-pMA質體。表現載體pMax-AD169-gB-SLP1-Del2由AD169-gB-SLP1-pMA及載體質體Del2-pMA建構。pMA-gB-SLP1載體以HindIII及ClaI限制，且藉由凝膠純化分離編碼SLP1-Del-2蛋白質之N端部分的1964 bp之DNA片段。載體質體Del2-pMA以ClaI及SacI消化，且藉由凝膠純化分離編碼gB-SLP1-Del2蛋白質之C端部分的420 bp之DNA片段。此兩個片段一起接合至以HindIII及SacI限制之pMax表現載體中，產生最終表現載體pMax-AD169-gB-SLP1-Del2。在藉由自動DNA定序核對序列之後，使用pMax-AD169-gB-SLP1-Del2重組質體短暫轉染CHO-S細胞。編碼gB-SLP1-Del2之核苷酸序列在SEQ ID NO:7中顯示。 1.4　gB-SLP12-Delta113
在gB-SLP12-Delta113變異體中進行在胺基酸793處開始的細胞質域之C端部分的缺失，以及跨膜結構域之胺基酸701-775的缺失。此變異體編碼717個胺基酸長的蛋白質。gB-SLP12-Delta113變異體之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:12中給出。 1.4.1　載體pTT5-gB-SLP12-Delta113之建構
用於建構pTT5-gB-SLP12-Delta113表現載體之策略如下。首先，以HindIII及ClaI限制pMax-AD169-gB-SLP12載體(參看第1.1.1節)。藉由凝膠純化分離對應於gB-SLP12-Delta113構築體之N端部分的所得1970-bp之gB片段。gB-SLP12-Delta113構築體之涵蓋ClaI及BamHI位點之C端末端(緊接終止密碼子之後)由Geneart合成，且以選殖至pMA載體中之230-bp的長DNA插入物(稱為new-2)(Geneart專屬質體)接收。New-2-pMA載體以ClaI及BamHI限制且將230-bp插入物凝膠純化。兩個凝膠純化之DNA片段一起接合至先前以HindIII及BamHI限制之pMax表現載體中，產生pMax-AD169-gB-SLP12-Delta113質體。接著，AD169-gB-SLP12-Delta113構築體之位置50及357處的絲胺酸皆使用來自Stratagene之「QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis」套組(第200513號)回復成天然精胺酸。序列核對後的所得質體以限制酶HindIII及BamHI消化。將2200-bp之gB片段凝膠純化且接合至先前以HindIII及BamHI限制之pTT5載體(NRC,Canada)中，產生最終pTT5-gB-SLP12-Delta113表現載體。此載體用於短暫轉染CHO-S細胞。編碼gB-SLP12-Delta113之核苷酸序列在SEQ ID NO:11中顯示。 1.5 gB-SLP12-Delta725
在gB-SLP12-Delta725中進行在胺基酸725處開始的部分跨膜結構域及整個細胞質域的缺失。此變異體編碼724個胺基酸長的蛋白質。gB-SLP12-Delta725變異體之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:10中給出。 1.5.1　表現載體pTT5-gB-SLP12-Delta725之建構
首先，gB-SLP12-De12構築體之位置50及357處的絲胺酸(參看第1.2節)皆使用來自Stratagene之「QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis」套組(第200513號)回復成天然精胺酸。序列檢驗後的所得質體以限制酶HindIII及ClaI消化，且藉由凝膠純化分離所得1970-bp之gB片段。亦產生涵蓋ClaI及BamHI限制位點(SEQ ID NO:26)且包含以下序列之PCR片段：ATCGATCCCCTGGAGAACACCGA

GAGGATCC。1970-bp之HindIII-ClaI片段及以ClaI及BamHI限制之PCR DNA一起接合至pTT5載體(NRC,Canada)中的HindIII與BamHI選殖位點之間，產生最終pTT5-gB-SLP12-Delta725表現載體。在藉由自動DNA定序檢驗序列之後，使用pTT5-gB-SLP12-Delta725重組質體短暫轉染CHO-S細胞。編碼gB-SLP1-Delta725之核苷酸序列在SEQ ID NO:9中顯示。 1.6 gB-SLP12-Delta725-LVL759
此變異體編碼683個胺基酸長的蛋白質。gB-SLP12-Delta725-LVL759之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:14中給出。 1.6.1　表現載體pTT5-AD169-Delta725-LVL759之建構
使用來自Stratagene之QuickChange II XL定點突變誘發套組(第200522號)以及引子CAN1498 5'-gtgcatcgtgtgcctgggatccgaggccgtgagccacagg-3'及CAN1499 5'-cctgtggctcacggcctcggatcccaggcacacgatgcac-3'使pTT5-gB-SLP12-Delta725-RR-前導2質體發生突變，產生中間質體pTT5-694-13。此中間質體使用相同QuickChange II XL定點突變誘發套組以及引子CAN1650 5'-gtgaacctgtgcatcgtgtgcctggccctggccagccaccgggccaacgagacaa-3'及CAN1651 5'-ttgtctcgttggcccggtggctggccagggccaggcacacgatgcacaggttcac-3'發生突變，產生最終表現載體pTT5-gB-SLP12-725-LVL759。編碼gB-SLP12-Delta725-LVL759之核苷酸序列在SEQ ID NO:13中顯示。 1.7 gB-SLP12-Delta725-LVL776
此變異體編碼683個胺基酸長的蛋白質。gB-SLP12-Delta725-LVL776變異體之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:16中給出。 1.7.1　表現載體pTT5-AD169-Delta725-LVL776之建構
上述中間質體pTT5-694-13使用相同QuickChange II XL定點突變誘發套組以及引子CAN1648 5'-cctgtgcatcgtgtgcctgggagccctggccagccaccgggccaacgagacaatc-3'及CAN1649 5'-gattgtctcgttggcccggtggctggccagggctcccaggcacacgatgcacagg-3'發生突變，產生另一中間質體pTT5-LVL758-1。此中間質體使用相同QuickChange II XL定點突變誘發套組以及引子CAN1697 5'-tggtgtgcgtgaacctgtgcatcgtgctcctgggagccctggcccaccgggccaacgagacaatctac-3'及CAN1698 5'-gtagattgtctcgttggcccggtgggccagggctcccaggagcacgatgcacaggttcacgcacacca-3'發生突變，產生最終載體表現pTT5-gB-SLP12-Delta725-LVL776。編碼gB-SLP12-Delta725-LVL759之核苷酸序列在SEQ ID NO:15中顯示。 1.8 gB-SLP12-Delta725-CD33
gB-SLP12-De1ta725-CD33變異體編碼677個胺基酸長的蛋白質。此構築體與gB-SLP12-Delta725構築體幾乎相同，但涵蓋核苷酸1至192的gB基因之N端部分(成熟gB蛋白的信號序列及前64個胺基酸)置換為CD33之信號序列(Taylor等人,1999,第274卷，第17期：第11505-11512頁)。gB-SLP12Delta725-CD33變異體之完整胺基酸序列在SEQ ID NO:18中給出。 1.8.1　表現載體pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33之建構
藉由PCR擴增，使用pTT5-gB-SLP12-Delta725質體作為模板以及引子CD33(SEQ ID NO:27)(5'-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTGCTTCTGCTGCCCCTGCTTTGGGCAGGGGCCCTGGCCCACCGGGGCAACG-3')及CMO578(SEQ ID NO:28)(5'-GTAATAGGATCCGGTACCTCATCAGGCCTTTCCAGCAG-3')建構gB-SLP12-Delta725-CD33基因。正向引子含有HindIII位點及CD33信號序列。反向引子含有終止密碼子及BamHI位點。在以適當酶限制之後，PCR片段選殖至以HindIII及BglII限制之pEE14載體中。在序列核對後，選擇pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33重組質體。最終，gB-SLP12-Delta725-CD33基因如下次選殖至pTT5載體中。使用pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33載體作為模板以及引子CD33F(SEQ ID NO:29)(5'-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTG-3')及Ecto-Rv(SEQ ID NO:30)(5'-GACTTATAGGATCCTCATCAGTGGTGGTGATGATGGTGGCCGCCGGCCTTTCCAGCAGC-3')對編碼序列進行PCR擴增。正向及反向引子分別含有HindIII及BamHI選殖位點。在接合之前，以HindIII及BamHI限制擴增之DNA及pTT5載體。在序列核對後，所得pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33表現載體用於短暫轉染CHO-S細胞。編碼gB-SLP12-Delta725-CD33之核苷酸序列在SEQ ID NO:17中顯示。實例2：表現CMV gB多肽
使用來自Invitrogen之FreeStyle^TM MAX CHO表現系統在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中短暫轉染上文所述之不同DNA構築體。編碼多肽gB-DeltaTM之構築體用作對照。gB-Delta TM之胺基酸序列在SEQ ID NO:2中描繪。用於表現gB-DeltaTM之表現載體為pMax-AD169。FreeStyle^TM MAX CHO系統使用CHO-S細胞株(適用於懸浮液之常見CHO-K1細胞株之各別子純系)及作為轉染試劑的基於陽離子脂質之合成聚合物。使用Qiagen Maxiprep套組(Qiagen,Valencia,CA)遵照製造商方案分離用於轉染之質體DNA。如Invitrogen所推薦製備轉染複合物。簡言之，在0.6 ml Opti-Pro^TMSFM介質中單獨稀釋37.5 μg質體及37.5 μl FreeStyle MAX轉染試劑。隨後，將稀釋之FreeStyle MAX轉染試劑添加至稀釋之DNA溶液中。DNA-FreeStyle MAX混合物在室溫下培育10分鐘，隨後添加至細胞培養物中。轉染之培養物在37℃下培育3天。接著，培養物在29℃下再保持3天時間。在轉染後第6天，收集1 ml包含懸浮液中之轉染細胞以及細胞培養基的各細胞培養物。藉由在12,000 g下離心分離細胞培養物上清液與懸浮細胞。收集上清液且以1 ml溶解緩衝液(補充有1% Triton X-100之PBS)溶解細胞丸粒。藉由在4℃下在12,000 g下離心5分鐘自細胞溶解產物移除不溶性材料。使用MOPS緩衝液使培養物上清液及溶解細胞部分之等分試樣(15 μl)在Criterion XT 4-12% Bis Tris凝膠(Biorad)上跑凝膠。將蛋白質轉移至硝基纖維素膜，且膜以抗-gB抗體MAb 27-156探測(Spaete等人,1990)。或者，藉由Elisa檢定，使用抗gB抗體偵測表現及分泌程度。在96孔板中進行檢定。板以多株抗gB抗體(抗體藉由在家兔體內注射多肽gB產生**-描述於EP0759995中)塗覆。在37℃下在3%脫脂牛乳中持續1小時的飽和步驟後，抗體在4℃下培育隔夜。接著洗滌各孔4次。在37℃下與生物素結合2小時的單株抗gB抗體(藉由以完整CMV病毒注射小鼠產生之抗體)存在下，將待測試之各樣品(上清液及以既定gB構築體轉染之細胞部分)的一系列10份2倍稀釋液添加至經塗覆板中。在以0.1% PBS/Tween 20洗滌4次後，添加100 μl抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶且在37℃下培育30分鐘。各板以0.1% PBS/Tween 20洗滌4次且以水洗滌1次。接著，在37℃下將各板與100 μl含75%四甲基-聯苯胺(TMB)之0.1 M檸檬酸鹽緩衝液pH 5.8(25%)一起培育10分鐘。以100 μl H₂SO₄ 0.4 N中止此反應，且在分光光度計中在450/620 nm下讀取色度。在此實驗中使用先前批次的濃度已知之經純化gB-DeltaTM作為標準物。使用軟體SoftMax Pro定量待測試之各樣品的濃度。 2.1 gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及gB-SLP12-Del2之表現及分泌-西方墨點分析
圖3中顯示獨立進行的三個實驗之代表性西方墨點-泳道A、B、C及D分別表示以gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及gB-SLP12-Del2轉染之培養物的細胞部分。該等細胞部分中存在之gB的含量指示胞內gB之含量。泳道E、F、G及H分別表示以gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及gB-SLP12-Del2轉染之培養物的上清液。該等上清液中存在之gB的含量指示分泌之gB的含量。若比較泳道B、C及D中存在之gB含量與泳道A中存在之gB含量，應注意當融合環(亦即本發明多肽)突變時的胞內gB含量相較於具有完整融合環之gB-DeltaTM(亦即先前技術之多肽)的胞內gB含量保持不變，表明融合環中之突變不影響分泌。實際上，若比較泳道F、G及H中存在之gB含量與泳道E中存在之gB含量，則觀測到本發明gB多肽(具有突變融合環)之表現及其分泌至少與先前技術之gB多肽(具有完整融合環之gB-DeltaTM)的表現及分泌一樣高效。 2.2　gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725之表現及分泌-Elisa檢定
藉由Elisa檢定獲得且以關係圖形式表示之結果的定量顯示於圖4中-黑條表示分別以gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及gB-Delta725轉染之培養物的細胞部分，而灰條表示同一培養物之上清液。因此，每個表現變異體之灰條與黑條之總和表示在CHO細胞中轉染後實現的總表現之程度。關於gB-DeltaTM，觀測到在所表現多肽之群體內，約一半多肽保留於胞內(灰條)且約一半多肽分泌(黑條)，驚奇的是，當表現gB-SLP12時，觀測到總表現程度顯著高於gB-DeltaTM，約2倍。此外，若比較胞內形式與分泌形式的各別程度，觀測到超過80%多肽分泌，而僅10-20%保留於胞內，表明gB-SLP12亦比gB-DeltaTM更有效分泌。此結果表明融合環之突變對表現及分泌具有積極影響。在多肽gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725中類似地觀測到超過gB-DeltaTM之較高表現及分泌程度。然而，驚人的是，此兩個多肽的表現甚至分別比gB-SLP12顯著2倍以上及約1.6倍，表明至少部分細胞質域缺失與融合環突變組合進一步改良表現，且因此改良所得分泌多肽之最終產率。 2.3　gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB-SLP12-Delta725、 gB-SLP12-之表現及分泌-融合環的作用
西方墨點展示於圖5-圖5A中，顯示gB-SLP12至少與gB-SLP12-Delta725同樣有效地分泌，其皆顯示比gB-DeltaTM(將泳道F及J與泳道B比較)高的分泌程度，證實由Elisa檢定觀測到的結果。泳道M及N表示以具有完整融合環FL1及FL2之gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的細胞部分及上清液。培養物上清液中無gB缺失存在(參看泳道N)表明gB之良好表現/分泌程度需要融合環突變-在圖5B中作出類似觀測，其中以具有完整融合環FL1及FL2之gB-Delta725轉染之培養物的上清液相較於以gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的上清液不能偵測到gB蛋白(分別比較泳道6與2)。針對多肽gB-SLP12-Delta113，類似地觀測到需要融合環FL1及FL2突變來實現優於gB-DeltaTM的分泌。相較於以gB-SLP12-Delta113轉染之培養物的上清液，在以具有完整融合環FL1及FL2之gB-SLP12-Delta113轉染之培養物的上清液中幾乎偵測不到gB(分別比較泳道6'及4')。 2.4　gB-SLP12-Delta725、gB-SLP12-Delta725-LVL759及gB-SLP12-Delta725-LVL776之表現及分泌
西方墨點展示於圖5C中-以gB-SLP12-Delta725-LVL759轉染之培養物的上清液中存在之gB的含量至少與以gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的上清液中存在之gB的含量一樣多(分別比較泳道f及h與泳道b及d)。以gB-SLP12-Delta725-LVL776轉染之培養物的上清液中存在之gB的含量僅略微低於以gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的上清液中存在之gB的含量(分別比較泳道j及1與泳道b及d)。此等結果指示本發明多肽之N端部分的突變(參看圖2)不會顯著影響該等多肽之分泌程度。實例3：CMV gB多肽之產物概況
gB-DeltaTM、gB-SLP12及gB-SLP1-Del2如實例2中所述在CHO細胞中短暫表現，且在轉染6天後收集培養物上清液。澄清後，為上清液補充350 mM NaCl及0.4% Empigen，接著進行0.22 μm過濾。使用鎳管柱自對應於細胞之培養物上清液純化經轉染及分泌之多肽。以包含10 mM TRIS-HCl、350 mM NaCl、10 mM咪唑及0.4% Empigen pH 8.0的緩衝液平衡XK 16管柱(Qiagen)。以4 ml/min之流動速率裝載先前經澄清、補充及過濾之細胞培養物上清液，且保留之蛋白質以平衡緩衝液洗滌。在4 ml/min之流動速率下以包含10 mM TRIS HCl、350 mM NaCl、350 mM咪唑及0.4% Empigen pH 8.0之緩衝液進行溶離。溶離份接著以2 ml/min之流動速率注射至以包含10 mM磷酸鹽(K)緩衝液及0.4% Empigen pH 7.2之緩衝液平衡的XK 26管柱(GE)中。採集第一蛋白質峰以供進一步分析。對應於此峰之溶離份接著裝載至以包含10 mM磷酸鹽(K)及0.4% Empigen pH 7.2之緩衝液平衡的cellufine硫酸鹽管柱(Chisso公司)上。以包含5 mM磷酸鹽(K)、1 M NaCl及0.1% Pluronic F68 pH 7.2之緩衝液在3 ml/min之流動速率下進行溶離。接著對上述純化方法產生之經純化多肽進行以下實驗。 3.1　戊二醛交聯實驗
戊二醛直接添加至15 μl每一經純化多肽(對應於約7 μg總蛋白質)中，從而獲得0.5%及1%的最終戊二醛濃度。作為對照，使各經純化多肽之樣品不含戊二醛。混合物培育150分鐘，接著藉由添加NaBH₄(Aldrich)中止戊二醛反應，且樣品在冰上培育20分鐘。樣品接著使用MOPS緩衝液在Criterion XT 4-12% Bis Tris凝膠(Biorad)上跑凝膠。凝膠以庫馬斯藍R-250染色且展示於圖9中。結果
若樣品在以戊二醛處理之前存在多肽多聚體，則任何既定尺寸之多聚體(不管二聚體、三聚體或任何其他高分子量多聚體)交聯，且因此當在變性條件下在凝膠上遷移時保持原樣。因此，該等多聚體根據其分子量遷移。相反，對於未以戊二醛處理之對照樣品，該樣品中存在之任何多聚體在變性條件下在凝膠上遷移時變性成單體，使得對照樣品中之多肽根據等於多肽單體之分子量遷移(參看泳道A、D及G中略低於150 kDa之單個條帶)。若考慮gB-DeltaTM之多聚體概況(泳道A、B及C)，在以戊二醛處理之樣品中觀測到2個極高分子量之條帶(由箭頭表示)。亦注意到，此兩個條帶具有相同強度，表明gB-DeltaTM樣品主要包含兩種類型之多聚體，且樣品中各多聚體之比例應大致相同。相反，當考慮gB-SLP12概況(詳言之泳道E及F)時，其中樣品以戊二醛處理，同時亦觀測到兩個高分子量條帶，各條帶之強度顯著不同。實際上，較低分子量條帶之強度比最高者強至少3-5倍，表明gB-SLP12樣品中較低分子量多聚體群比較高分子量多聚體群大得多。當考慮gB-SLP1-Del2樣品(泳道G、H及I)時進行類似觀測，其中較低條帶之強度比較高條帶之強度強約2-3倍。此表明gB-SLP12及gB-SLP1-Del2具有類似多聚體概況，其中較低分子量多聚體呈現增濃比例，此與先前技術多肽gB-DeltaTM不同。應注意，彼實驗中所用凝膠不提供足夠良好以判斷與gB-DeltaTM有關之泳道中觀測到的較低分子量條帶是否與gB-SLP12及gB-SLP1-Del2有關之泳道中觀測到的具有相同尺寸的解析度。出於相同原因，不能精確測定各條帶之實際尺寸，使得難以自此實驗識別所觀測的多聚體為二聚體或三聚體等...。為了獲得此資訊，使用經純化多肽進行以下兩個實驗。 3.2　分析型超離心-gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2
使用分析型超離心(AUC)，藉由量測響應離心力之分子移動速率，測定經純化多肽樣品中之不同物質(例如聚集之不同尺寸之經純化多肽的多聚體)溶液中的均質性及尺寸分佈。此係基於視分子形狀及質量而定藉由沈降速度實驗獲得的不同物質之沈降係數的計算。純化之後，再懸浮於10 mM磷酸鈉、1 M NaCl及0.1% Pluronic，pH 7.2中之gB-DeltaTM、gB-SLP12及gB-SLP1-Del2在AN-60Ti轉子平衡至15℃之後在Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1分析型超離心機中在28 000 rpm下旋轉。為了收集資料，在280 nm及230 nm下每5分鐘記錄160次掃描。使用程式SEDFIT進行資料分析以測定C(S)分佈。蛋白質之部分比容積使用SEDNTERP軟體自其胺基酸序列與其預期聚糖組成之組合測定。SEDNTERP亦用於藉由忽略Pluronic F68之作用測定緩衝液之黏度及密度，該作用在此軟體之資料庫中未提供。結果以各物質之濃度針對分子量繪製的曲線圖形式呈現。藉由將整體分佈之總曲線下面積視為100%樣品且藉由計算由每一物質作用表示的此總面積之百分比來測定所有物質之相對豐度。結果
圖10連續展現藉由分析型超離心分析的經純化gB-DeltaTM、gB-SLP12及gB-SLP1-De12之概況。對應於gB-DeltaTM樣品之曲線圖指示由複數個峰表示之異質分佈。詳言之，在該樣品中觀察到的主要群體為417 kDa(35%)及723 kDa(30%)之物質，其可能分別表示三聚體及六聚體。該樣品中亦存在較高分子量多聚體。相反，當融合環FL1及FL2突變時，相應經純化gB-SLP12多肽之概況指示較均質群體，這是因為主要群體為可能表示三聚體的327 kDa之物質(63%)。幾乎未注意到較高分子量多聚體之存在。在gB-SLP1-De12樣品中觀察到類似概況，其中主要群體為311 kDa之物質(67%)，其亦可能表示三聚體，而較高分子量多聚體之存在僅為邊緣性的。
總之，本發明之gB多肽(gB-SLP12及gB-SLP1-De12)呈現改良之產物概況，這是由於三聚體群體相較於先前技術之gB多肽(gB-DeltaTM)的三聚體群體增加約2倍。 3.3　分析型超離心-gB-SLP12-Delta725、gB-SLP12-Delta113
如上文第3.2節中所述進行分析型超離心，以測定經純化多肽gB-SLP12-Delta725及gB-SLP12-Delta113中不同物質之溶液中的均質性及尺寸分佈。多肽如實例2中所述重組表現，且如本發明實例3之第一段所述純化。純化之後，gB-SLP12-Delta725及gB-SLP12-Delta113各自再懸浮於包含0.1% Pluronic之緩衝液或無Pluronic之緩衝液中。結果
-圖11A連續展現藉由分析型超離心在有或無0.1% Pluronic存在下分析的經純化gB-SLP12-Delta113多肽之概況。在無Pluronic存在下，觀察到的概況類似於圖10中針對gB-SLP12及gB-SLP12-Del2觀察到的概況，其中類似72%群體表示經純化多肽群體內之三聚體，亦即相較於先前技術之gB多肽(gB-DeltaTM)改良之產物概況。然而，在Pluronic存在下，三聚體百分比降低，伴隨單體百分比增加(25%)且存在尺寸約為230 kDa之多聚體。gB-SLP12-Delta113多肽在Pluronic存在下單體化之此傾向指示容易清潔。
-圖11B連續展現藉由分析型超離心在有或無0.1% Pluronic存在下分析的經純化gB-SLP12-Delta725多肽之概況。不管是否有Pluronic存在，在此經純化多肽中觀察到的概況類似。實際上，三聚體百分比在兩種情形下均為約70%，亦即與上文gB-SLP12及gB-SLP12-Del2多肽觀察到的三聚體百分比一樣高，且因此gB-SLP12-Delta725相較於先前技術之gB多肽(gB-DeltaTM)亦呈現改良之產物概況。結論
儘管gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725皆顯示改良之產物概況(三聚體比例增濃)，但獲得之結果指示gB-SLP12-Delta725呈現在溶液中具有增加之結構穩定性的額外益處，這是由於其三聚體概況在有或無Pluronic存在下皆維持。實際上，清潔劑處理對彼多肽之沈降特性不具有可觀測之影響。 3.4　尺寸排阻層析法
經純化gB-DeltaTM及gB-SLP12之蛋白質尺寸亦藉由尺寸排阻層析法使用280 nm下的UV偵測器及TSK G5000PWXL管柱(Tosoh Bioscience)測定。在室溫下，在0.5 ml/min之流動速率下裝載樣品。在室溫下使用PBS+0.1% Pluronic在相同流動速率下進行溶離。使用甲狀腺球蛋白(669 kDa)、鐵蛋白(440 kDa)、過氧化氫酶(232 kDa)、醛縮酶(158 kDa)、白蛋白(68 kDa)、伴白蛋白(75 kDa)、卵白蛋白(43 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)及核糖核酸酶(13.7 kDa)進行校準。結果
如圖13所示，gB-SLP12的尺寸如尺寸排阻層析法所量測為357 kDa，其可能表示三聚體形式。先前技術之兩個多肽gB-DeltaTM及gB-S50-DeltaTM(亦即具有完整融合環之多肽)具有710 kDa之類似尺寸，其表示較高分子量之多聚體。此等結果證實以分析型超離心獲得之上述結果：本發明多肽(gB-SLP12)之產物概況與先前技術之多肽(gB-DeltaTM)的產物概況不同。實例4：gB-SLP12多肽之C端剪裁4.1　表現及純化
將gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725多肽如實例2中所述短暫轉染及表現。gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725多肽如實例3之第一段中所述進行純化。在轉染後第6天收集後，對gB-DeltaTM上清液補充Bis-Tris及Empigen BB，分別達到最終濃度20 mM及0.4%。接著裝載至在包含20 mM Bis-Tris-0.4% Empigen BB，pH 6.0之緩衝液中平衡之Q-Sepharose XL管柱(GE Healthcare)上。使用75%包含20 mM Bis-Tris-0.4% Empigen BB，pH 6.0之緩衝液與25%包含20 mM Bis-Tris-0.4% Empigen BB-1 M NaCl，pH 6.0之緩衝液的混合物自管柱溶離結合之多肽。隨後對溶離液補充磷酸鈉以達到10 mM之最終濃度，且調整至pH 6.8。接著裝載至在包含10 mM磷酸鈉-0.4% Empigen BB-0.25 M NaCl，pH 6.8之緩衝液中平衡的II型羥基磷灰石管柱(Bio-Rad)上。回收含有多肽之流經液且裝載至以包含10 mM磷酸鈉-0.4% Empigen BB-0.25 M NaCl，pH 6.8之緩衝液平衡的Cellufine硫酸鹽管柱(JNC公司)上。回收含多肽之流經液，使用100 kD Pellicon XL膜(Millipore)藉由超濾濃縮，且裝載至在包含10 mM磷酸鈉-0.4% Empigen BB，pH 7.2之緩衝液中平衡的Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。收集溶離液，濃縮且與10 mM磷酸鉀，pH 7.2一起滲濾。 4.2　西方墨點分析
使用N-糖苷酶F去糖基化套組(Roche,第11836552001號)遵照製造商說明將上述經純化多肽去糖基化。使用MOPS緩衝液使等量之各經純化去糖基化多肽在Criterion XT 4-12% Bis Tris凝膠(Biorad)上跑凝膠。將蛋白質轉移至硝基纖維素膜上且膜以抗gB抗體MAb 27-156(Spaete等人,Virology 167,207-225(1988))(圖14A，圖14B，泳道3，圖14C，泳道B，及圖14D，泳道D)或抗6X His標籤抗體(Abcam,第ab9108號)(圖14B，泳道2，圖14C，泳道A及圖14D，泳道C)探測。結果
-圖14A顯示抗gB抗體識別經純化gB-DeltaTM多肽之群體中的兩種不同形式，表明多肽在經純化群體中分別以至少兩種不同尺寸的形式(92 kDa及80 kDa)存在。基於胺基酸分子量之平均值(110 Da)，包含830個胺基酸之gB-DeltaTM之分子量應為約91 kDa。因此，92 kDa條帶可能對應於全長gB-DeltaTM多肽，而80 kDa條帶可能對應於較短型式之多肽，表明在群體內，一些多肽裂解且產生約80kDa之經剪裁產物。
-圖14B顯示，在細胞中重組表現gB-SLP12多肽後，抗gB抗體(泳道3)提供分別識別兩種類似尺寸形式(92 kDa及80 kDa)的相同概況，表明此多肽中發生類似裂解。此處應注意，gB-SLP12之預期分子量亦為約91 kDa，這是因為胺基酸數目與gB-DeltaTM的相同。當以抗-His標籤抗體(泳道2)探測膜時，僅偵測到約92 kDa之條帶。因為His標籤位於多肽之C端末端，所以此等資料提示多肽之C端末端發生裂解，且因此產生失去C端末端之80 kDa片段。
-圖14C顯示在細胞中重組表現gB-SLP12-Delta113多肽之後，抗gB抗體(泳道B)僅識別一個條帶(約80 kDa)。因為gB-SLP12-Delta113包含717個胺基酸，所以其預期平均分子量應為約79 kDa。因此，僅在約80 kDa處觀察到一個條帶提示此經純化多肽之群體僅由全長多肽構成，表明此多肽群體中不再出現C端部分先前觀察到之裂解。此藉由以抗His標籤抗體(泳道A)探測膜且在約80 kDa處觀察到相同條帶來確認，表明多肽之C端末端存在。
-由在圖14D中呈現的關於多肽gB-SLP12-Delta725之西方墨點可得出類似結論。泳道D表示以抗gB抗體探測之膜，該抗體僅識別一個條帶(在約80 kDa處)。此包含824個胺基酸之多肽的預期平均分子量亦應為約79 kDa。泳道C表示以抗His標籤抗體探測之膜，且類似地僅識別一個在約80 kDa處之條帶，提示多肽之C端末端之存在。
-多肽可參與去糖基化過程，此可能導致不完全去糖基化。當去糖基化不完全時，一些多肽仍呈其糖基化形式，該等形式通常以擴散方式在凝膠中遷移，諸如在圖14C及圖14D中呈現的西方墨點中之多肽gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725中觀察到的。結論
圖14中呈現之資料顯示多肽gB-DeltaTM及gB-SLP12在多肽之C端部分出現的剪裁在缺失至少部分細胞質域時不會發生。實例5：多肽gB-SLP12-Delta725之N端異質性
如圖12A中所示，CMV gB-SLP12-Delta725多肽當在細胞中重組表現時產生在N端末端處為異質的成熟多肽群體。實際上，如所指示，信號肽酶偶然裂解掉在不同胺基酸位置處之信號序列。此現象亦稱為信號肽酶「擺動」。 5.1　表現及純化
使如實例1中所述的含有His標籤之gB-SLP12-Delta725、gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776及gB-SLP12-Delta725-CD33多肽如實例2中所述重組表現。轉染後第6天，收集培養物上清液。向上清液中添加無EDTA之蛋白酶抑制劑混合液(Roche,第11873580001號)，且NaCl濃度調整至500 mM，且最終pH值調整至8.3。將IMAC瓊脂糖凝膠6 FF(GE Healthcare)裝填至5 cm直徑之玻璃管柱(Waters)中。管柱以5管柱體積之結合緩衝液(10 mM Tris、500 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 8.3)平衡。將上清液以10 ml/min之流動速率裝載至平衡管柱上。未結合材料以2管柱體積之上述結合緩衝液洗滌。採集50 ml溶離份。管柱以另外2管柱體積之上述結合緩衝液進一步洗滌。採集10 ml溶離份。結合於管柱之蛋白質以6管柱體積之溶離緩衝液(Tris、500 mM NaCl、350 mM咪唑，pH 8.30)溶離。採集10 ml溶離份。將溶離份裝載至SDS-PAGE凝膠上且彙集帶正電溶離份且以Centricon超濾裝置(Millipore)濃縮。濃縮蛋白質藉由RCDC改良之Lowry比色檢定(Biorad)定量。使用N-糖苷酶F去糖基化套組(Roche,第11836552001號)遵照製造商說明將5至10 μg經純化蛋白質去糖基化。去糖基化蛋白質藉由RCDC沈澱反應物(BioRad)沈澱，再懸浮於SDS-PAGE還原裝載緩衝液中且裝載至SDS-PAGE上。剪下在對應於去糖基化蛋白質之位置處遷移的蛋白質條帶以供胰蛋白酶消化及MS/MS肽圖譜分析。 5.2　胰蛋白酶消化
用乙腈(ACN)使含有經純化蛋白質之凝膠塊脫水。藉由在40℃下添加還原緩衝液(10 mM DTT、100 mM碳酸氫銨)使蛋白質還原30分鐘，且藉由在40℃下添加烷基化緩衝液(55 mM碘乙醯胺、100 mM碳酸氫銨)烷基化20分鐘。凝膠塊接著藉由在40℃下添加ACN持續5分鐘來進一步脫水及洗滌，隨後丟棄所有試劑。隨後在40℃下乾燥凝膠塊5分鐘，接著在4℃下使用胰蛋白酶溶液(6 ng/μl來自Promega之定序級胰蛋白酶，25 mM碳酸氫銨)再水合40分鐘。在58℃下進行蛋白質消化1小時，且使用1%甲酸與2% ACN 之15 μl混合物停止。上清液轉移至96孔板中且使用室溫下的兩個30分鐘萃取步驟使用萃取緩衝液(1%甲酸及50% CAN)萃取胰蛋白酶消化之肽。所有經萃取之肽彙集於96孔板中，接著在真空離心機中完全乾燥。將板密封且在-20℃下儲存直至進一步處理用於LC-MS/MS分析。 5.3　質譜分析
在LC-MS/MS分析之前，經萃取之肽在攪拌下再溶解於12 μl 0.2%甲酸中持續15分鐘，接著在2000 rpm下離心1分鐘。LC管柱為以高壓裝填單元裝填之C18逆相管柱。以C18 Jupiter 5 lm 300 逆相材料(Phenomenex)裝填100 mm長的75 lm i.d.熔融二氧化矽毛細管。將此管柱安裝於奈米LC-2D系統(Eksigent)上且與LTQ Orbitrap(ThermoFisher Scientific)耦接。用於層析之緩衝液為0.2%甲酸(緩衝液A)及100% ACN/0.2%甲酸(緩衝液B)。在前12分鐘期間，以650 nl/min之流動速率將5 μl樣品裝載至管柱上，且隨後梯度在20分鐘內自2至80%緩衝液B，接著返回2%緩衝液B持續10分鐘。使用由Orbitrap中獲取之掃描事件1的全掃描MS構成的4個掃描事件循環完成LC-MS/MS資料獲取。結果
-圖12顯示所測試不同多肽之信號序列的裂解位點處出現之信號肽酶「擺動」的定量評估結果。信號肽酶擺動導致產生所指示多肽之群體內在N端末端處以不同胺基酸開始的多種成熟多肽形式。
-圖12A顯示在胰蛋白酶消化全部蛋白質萃取物之後，繼之以藉由MS/MS對包含N端末端之所得肽進行相對定量，觀測到gB-SLP12-Delta725多肽群體在信號序列裂解後主要以5種不同多肽形式以相對相等比例(約10%至約30%範圍)存在於溶液中，各自如所指示以不同胺基酸開始。
-圖12B及圖12C分別顯示gB-SLP12-Delta725-LVL759及gB-SLP12-Delta725-LVL776之群體中存在的不同多肽形式的MS/MS相對定量之類似分析。觀測到彼兩種多肽之群體在信號序列裂解後主要以一種主要多肽形式以大於99%之百分比存在於溶液中，其分別以SEQ ID NO: 14中所述序列之位置23處之胺基酸及SEQ ID NO:16中所述序列之位置24處之胺基酸開始。藉由信號肽酶裂解且產生在N端末端具有不同胺基酸之兩種其他多肽形式的兩個替代裂解位點在各別多肽群體中呈現小至1%以下。
-圖12D顯示gB-SLP12-Delta725-CD33多肽群體中存在的不同多肽形式之MS/MS相對定量的類似分析。觀測到此群體在信號序列裂解後主要以一種主要多肽形式以大於99%之百分比存在於溶液中，其以SEQ ID NO: 18中所述序列之位置18處之胺基酸開始。藉由信號肽酶裂解且產生在N端末端具有不同胺基酸之一種其他多肽形式的另一裂解位點在gB-SLP12-Delta725-CD33多肽群體中呈現小至1%以下。結論
彼等結果指示gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776及gB-SLP12-Delta725-CD33多肽中不再出現擺動，這是因為信號肽酶僅一致識別一個主要裂解位點。此表明對gB多肽之信號序列及前導序列所作之修飾對成熟多肽群體之異質性具有顯著積極影響，賦予該等群體以大於99%程度之均質性。實例6：含有例示性本發明CMV gB多肽之免疫原性組合物的免疫原性
如下測試含有以下包含C端His標籤且如章節中所述表現及純化之多肽的免疫原性組合物的免疫原性：gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB-SLP12-Delta725、LVL759、LVL776及CD33。 6.1　實驗設計
10隻C57BL/6小鼠之組已使用上述例示性免疫原性組合物以21天時間間隔以兩個劑量進行疫苗接種，如表1中所示。已進行肌肉內免疫(1.5 μg各gB多肽，其以包含在總體積為50 μl之脂質體調配物中的2.5 μg 3D-MPL及2.5 μg QS21之佐劑系統ASA輔助)。
*多肽緩衝液：10 mM磷酸鹽K/K2緩衝液-500 mM NaCl-pH8+精胺酸
**多肽緩衝液：10 mM Tris-500 mM NaCl-pH 8.3+精胺酸
如第一次免疫後第21天及第二次免疫後第14天藉由中和(NT)檢定及ELISA(酶聯免疫吸附檢定)(分別參看第6.3節及第6.4節)所量測，藉由分析對疫苗接種的體液免疫反應評估免疫原性。 6.2　統計分析
已設計10隻C57BL/6小鼠之組以獲得90%檢定力，其中初始讀出有2倍差異。使用UNISTAT對第2次免疫後第14天的資料進行統計分析。用於分析方差之方案可如下簡單描述：對資料進行對數轉換；對各群體(組)進行Shapiro-Wilk測試以核對正規性；進行Cochran測試以核對不同群體(組)之間的方差齊性：對所選資料進行方差分析(ANOVA 1或2)；進行Tuckey-HSD測試以進行多重比較。 6.3　中和檢定
在檢定之前，將MRC5細胞接種至96孔板中且在37℃下培育3天。熱不活化血清之連續稀釋液與固定量之人類CMV AD169病毒一起在37℃下培育1小時。培育之後，向含有MRC5細胞之96孔板中添加血清與病毒之混合物。板在37℃下在2000 rpm下離心1小時。在37℃下培育隔夜後，各板以80%丙酮溶液(在+4℃下20-30分鐘)固定。移除丙酮溶液且在37℃下使用特異性單株生物素結合之抗即刻早期I(IE-I)抗體偵測CMV陽性孔持續1小時。板以PBS洗滌3次。洗滌之後，在37℃下再添加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶持續30分鐘。將板洗滌3次且與True-Blue溶液一起培育10分鐘。藉由在顯微鏡下目測記錄特定著色信號。中和效價表示為與無血清之對照病毒劑量比較時CMV陽性孔數目產生50%減少之最高血清稀釋的倒數。結果
對第一次免疫後第21天及第二次免疫後第14天收集的血清樣品量測中和抗體反應。測試樣品對人類CMV AD169病毒的中和活性。結果展示於圖15A中。所有測試多肽在第二次免疫後第14天誘導顯著反應(參看灰條)。gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB SLP12-Delta725及LVL759誘導之效價與gB-DeltaTM誘導之效價無顯著差異*。CD33(p值：0.0006)及LVL776(p值：0.0116)誘導顯著低於gB-DeltaTM之效價。
*p值0.05→無統計差異(95%信賴區間)
**p值<0.05→統計差異 6.4 ELISA檢定
藉由ELISA使用稱為gB**之gB多肽(EP0759995中描述)作為塗佈抗原進行抗gB抗體之定量。抗原以4 μg/ml之最終濃度(每孔100 μl)稀釋於PBS中且在4℃下在96孔板中培育隔夜。板接著在37℃下以200 μl含有1%牛血清白蛋白之PBS飽和1小時。向各孔中添加血清之兩倍連續稀釋液(每孔100 μl)且在37℃下培育1.5小時。板以0.1% PBS/Tween 20洗滌4次。向各孔中添加100 μl生物素結合之抗小鼠Ig且在37℃下培育1小時。在以0.1% PBS/Tween 20洗滌4次後，添加100 μl抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶以供在37℃下再培育30分鐘。各板以0.1% PBS/Tween 20洗滌4次且以水洗滌1次。接著，在22℃下將各板與100 μl含75%四甲基-聯苯胺之0.1 M檸檬酸鹽緩衝液pH 5.8一起培育10分鐘。以100 μl H₂SO₄ 0.4 N停止此反應，且在分光光度計中在450/620 nm下讀取色度。在此實驗中使用先前批次的濃度已知之經純化gB-DeltaTM作為標準物。使用軟體SoftMax Pro測定ELISA效價且以ELISA單位/毫升為單位來表示。結果
對第一次免疫後第21天及第二次免疫後第14天收集的血清樣品量測ELISA效價。結果展示於圖15B中。所有測試多肽在第二次免疫後第14天誘導顯著反應(參看灰條)。gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725誘導之效價與gB-DeltaTM誘導之效價無顯著差異。gB-SLP12、CD33、LVL759及LVL776誘導之效價無顯著差異*。gB-DeltaTM誘導之效價顯著高於**gB-SLP12(p值：0.0002)、CD33(p值：0.0226)、LVL759(p值：0.0002)及LVL776(p值：0.0001)。
*p值0.05→無統計差異(95%信賴區間)
**p值<0.05→統計差異
圖1為源自AD169病毒株之缺乏跨膜結構域之CMV gB多肽(gB-DeltaTM)以及其中揭示之三個例示性CMV gB多肽的圖示：(i)融合環FL1及FL2皆突變之缺失跨膜結構域之CMV gB(gB-SLP12)(參看SEQ ID NO:3)，(ii)融合環FL1及FL2之突變組合在C端細胞質域中缺失區域(Del2)的缺失跨膜結構域之CMV gB(gB-SLP12-Del2)(參看SEQ ID NO:4)，該缺失的區域(Del2)包含脯胺酸增濃結構域、保守疏水性模式及高度親水性帶負電區域，及(iii)融合環FL1之突變組合在多肽C端細胞質域中缺失上述區域(Del2)的缺失跨膜結構域之CMV gB(gB-SLP1-Del2)(參看SEQ ID NO:5)。gB-SLP12、gB-SLP12-Del2及gB-SLP1-Del2均包含兩個額外點突變，在位置50及357處以絲胺酸(S)取代精胺酸(R)。gB-SLP12-Del2及gB-SLP1-Del2皆包含另一點突變，在位置778處以丙胺酸(A)取代半胱胺酸(C)。TM代表跨膜結構域。FL1代表融合環1。FL2代表融合環2。Del2缺失以胺基酸825開始且以胺基酸877結束，亦即此兩個胺基酸分別為缺失區域之第一個胺基酸及最後一個胺基酸。指定編號係指源自AD169病毒株且如SEQ ID NO:1所述之CMV gB序列的胺基酸位置。
圖2為其中揭示之其他例示性CMV gB多肽的圖示。所有多肽均包含突變之融合環FL1及FL2。gB-SLP12-Delta113另外缺失跨膜結構域及細胞質域之C端部分，亦即胺基酸794至906。gB-SLP12-Delta725另外缺失整個細胞質域且保留部分跨膜結構域。LVL759(或gB-SLP12-Delta725-LVL759)、LVL776(或gB-SLP12-Delta725-LVL776)及CD33(或gB-SLP12-Delta725-CD33)的骨架與gB-SLP12-Delta725的相同，但N端末端除外，其中胺基酸序列如所指示改變。指定編號係指源自AD169病毒株且如SEQ ID NO:1所述之CMV gB序列的胺基酸位置。
圖3顯示對應於構築體gB-SLP12之pMax質體圖譜。
圖4顯示對應於構築體gB-SLP12-Delta725之pTT5質體圖譜。
圖5顯示與先前技術之缺失跨膜結構域之CMV gB多肽的表現及分泌程度相比，在CHO細胞中重組表現之三種不同例示性gB多肽的表現及分泌程度。所示為使用抗gB抗體之西方墨點分析，其指示由用指定gB構築體轉染之不同培養物產生的細胞部分(表示gB之未分泌形式)及培養物上清液(表示gB之分泌形式)中存在的gB蛋白(位於150 kDa與100 kDa之間的墨點上)之含量。泳道MW：分子量梯度，泳道A：用gB-DeltaTM轉染之培養物的細胞部分(C-Fr)，泳道B：用gB-SLP12轉染之培養物的C-Fr，泳道C：用gB-SLP1-De12轉染之培養物的C-Fr，泳道D：用gB-SLP12-De12轉染之培養物的C-Fr，泳道E：用gB-DeltaTM轉染之培養物的培養物上清液(C-Sn)，泳道F：用gB-SLP12轉染之培養物的C-Sn，泳道G：用gB-SLP1-De12轉染之培養物的C-Sn，泳道H：用gB-SLP12-De12轉染之培養物的C-Sn。
圖6顯示與缺失跨膜結構域之先前技術CMV gB多肽的表現及分泌程度相比，在CHO細胞中重組表現之三種不同本發明例示性gB多肽(gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及gB-SLP12-Delta725)的表現及分泌程度。所示為使用抗gB抗體之定量Elisa檢定，其展現細胞部分(黑條-表示gB之未分泌形式)及培養物上清液(灰條-表示gB之分泌形式)中存在的gB蛋白之含量。
圖7顯示在CHO細胞中重組表現的本發明之其他例示性gB多肽的表現及分泌程度。所示為使用抗gB抗體的三個西方墨點分析，其展現由用指定gB構築體轉染之不同培養物產生的細胞部分(C-Fr，表示gB之未分泌形式)及培養物上清液(C-Sn，表示gB之分泌形式)中存在的gB蛋白(位於150 kDa與100 kDa之間的墨點上)之含量。圖7A-泳道A、B、E、F、I、J、M及N表示總共2600個細胞中存在的蛋白質之量。泳道C、D、G、H、K、L、O及P表示總共520個細胞中存在的蛋白質之量。泳道MW：分子量梯度，泳道A及C：用gB-DeltaTM轉染之培養物的C-Fr，泳道B及D：用gB-DeltaTM轉染之培養物的C-Sn，泳道E及G：用gB-SLP12轉染之培養物的C-Fr，泳道F及H：用gB-SLP12轉染之培養物的C-Sn，泳道I及K：用gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的C-Fr，泳道J及L：用gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的C-Sn，泳道M及O：用gB-Delta725(具有完整融合環)轉染之培養物的C-Fr，泳道N及P：用gB-Delta725(具有完整融合環)轉染之培養物的C-Sn。圖7B-泳道1、2、5、6、1'、2'、5'及6'表示總共2600個細胞中存在的蛋白質之量。泳道3、4、7、8、3'、4'、7'及8'表示總共520個細胞中存在的蛋白質之量。泳道MW：分子量梯度，泳道1及3：用gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的C-Fr，泳道2及4：用gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的C-Sn，泳道5及7：用gB-Delta725(具有完整融合環)轉染之培養物的C-Fr，泳道6及8：用gB-Delta725(具有完整融合環)轉染之培養物的C-Sn，泳道1'及3'：用gB-SLP12-Delta113轉染之培養物的C-Fr，泳道2'及4'：用gB-SLP12-Delta113轉染之培養物的C-Sn，泳道5'及7'：用gB-Delta113(具有完整融合環)轉染之培養物的C-Fr，泳道6'及8'：用gB-SLP12-Delta113(具有完整融合環)轉染之培養物的C-Sn。
圖8顯示在CHO細胞中重組表現的本發明之其他例示性gB多肽的表現及分泌程度。圖8A-所示為使用抗gB抗體的西方墨點分析，其展現由用指定gB構築體轉染之不同培養物產生的細胞部分(C-Fr，表示gB之未分泌形式)及培養物上清液(C-Sn，表示gB之分泌形式)中存在的gB蛋白(位於150 kDa與100 kDa之間的墨點上)之含量。泳道a、b、c、d、i、j、k及l表示總共11700個細胞中存在的蛋白質之量，而泳道e、f、g、h、m、n、o及p表示總共5100個細胞中存在的蛋白質之量。泳道MW：分子量梯度，泳道a及e：用gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的C-Sn，泳道i及m：用gB-SLP12-Delta725轉染之培養物的C-Fr，泳道b及f：用CD33轉染之培養物的C-Sn，泳道j及n：用CD33轉染之培養物的C-Fr，泳道c及g：用LVL759轉染之培養物的C-Sn，泳道k及o：用LVL759轉染之培養物的C-Fr，泳道d及h：用LVL776轉染之培養物的C-Sn，泳道l及p：用LVL776轉染之培養物的C-Fr。圖8B-所示為使用抗gB抗體之定量Elisa檢定，其展現細胞部分(黑條-表示gB之未分泌形式)及培養物上清液(灰條-表示gB之分泌形式)中存在的gB蛋白之含量。
圖9顯示如戊二醛誘導之交聯所分析，多肽gB-DeltaTM、gB-SLP12及gB-SLP1-De12在CHO細胞中重組表現後的產物概況。所示為聚丙烯醯胺凝膠之影像。箭頭表示不同尺寸之多聚體。使用遞增劑量(0、0.5、1%)之戊二醛。泳道MW：分子量梯度，泳道A：gB-DeltaTM-0%戊二醛，泳道B：gB-DeltaTM-0.5%戊二醛，泳道C：gB-DeltaTM-1%戊二醛，泳道D：gB-SLP12-0%戊二醛，泳道E：gB-SLP12-0.5%戊二醛，泳道F：gB-SLP12-1%戊二醛，泳道G：gB-SLP1-De12-0%戊二醛，泳道H：gB-SLP1-De12-0.5%戊二醛，及泳道I：gB-SLP1-De12-1%戊二醛。
圖10顯示如分析型超離心(AUC)所分析，多肽gB-DeltaTM(A)、gB-SLP12(B)及gB-SLP1-De12(C)在CHO細胞中重組表現後的產物概況。如所示，各峰表示不同尺寸之多聚體。如所示，亦規定各肽群體中所識別之多聚體之百分比。
圖11顯示如所示且如分析型超離心(AUC)所分析，其他例示性CMV gB多肽在CHO細胞中重組表現後的產物概況。如所示，各峰表示不同尺寸之多聚體。如所示，亦規定各肽群體中所識別之多聚體之百分比。圖11A-展示在有(上圖)或無(下圖)Pluronic存在下獲得的gB-SLP12-Delta113多肽(如圖中之gB-Delta113所指示)之產物概況。圖11B-展示在有(上圖)或無(下圖)Pluronic存在下獲得的gB-SLP12-Delta725多肽(如圖中之gB-Delta725所指示)之產物概況。
圖12顯示藉由對在CHO細胞中重組表現及分泌後且在信號序列裂解掉之後產生的所示多肽之N端末端進行MS/MS圖譜分析的肽分析。圖12A指示信號序列裂解掉之後重組表現的gB-SLP12-Delta725群體內具有不同N端胺基酸之不同多肽的相對豐度。圖12B指示信號序列裂解掉之後重組表現的gB-SLP12-Delta725-LVL759群體內存在的具有不同N端胺基酸之不同多肽的相對豐度。圖12C指示信號序列裂解掉之後重組表現的gB-SLP12-Delta725-LVL776群體內存在之具有不同N端胺基酸之不同多肽的相對豐度。圖12D指示信號序列裂解掉之後重組表現的gB-SLP12-Delta725-CD33群體內存在之具有不同N端胺基酸之不同多肽的相對豐度。
圖13顯示如藉由基於UV之尺寸排阻層析(SEC-UV)所分析，多肽gB-DeltaTM、gB-S50-DeltaTM及gB-SLP12在CHO細胞中重組表現後的產物概況。各峰表示所示尺寸之多聚體。
圖14顯示使用抗gB抗體或抗His抗體之西方墨點分析，其展現所示多肽在重組表現、分泌、純化及去糖基化後的gB蛋白含量。圖14A對應於gB-DeltaTM且顯示以抗gB抗體探測之西方墨點。圖14B對應於gB-SLP12且顯示以抗His抗體(泳道2)及抗gB抗體(泳道3)探測之西方墨點。圖14C對應於gB-SLP12-Delta113且顯示以抗His抗體(泳道A)及抗gB抗體(泳道B)探測之西方墨點。圖14D對應於gB-SLP12-Delta725且顯示以抗His抗體(泳道C)及抗gB抗體(泳道D)探測之西方墨點。
圖15呈現免疫原性資料。圖15A顯示投與為注射而調配之所示多肽後誘導之中和效價。圖15B顯示投與為注射而調配之所示多肽後誘導之ELISA抗gB抗體效價。
圖16顯示如下文所述之序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:21。
<110>　比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司
<120>　新穎之抗原
<130> VB63857
<140>100137497
<141>2011-10-14
<150>61/393,413
<151>2010-10-15
<160>　38
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>　1
<211>　906
<212>　PRT
<213>　AD169巨細胞病毒
<220>
<223>　AD169巨細胞病毒
<400>　1

<210>　2
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
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<223>　AD169巨細胞病毒
<400>　38
(無元件符號說明)

权利要求:
Claims (48)
[1] 一種巨細胞病毒(CMV)gB多肽，其包含至少一部分gB蛋白胞外域，該胞外域包含融合環1(FL1)結構域及融合環2(FL2)結構域，其中該FL1及該FL2結構域中之至少一者包含至少一個胺基酸缺失或取代。
[2] 如請求項1之CMV gB多肽，其包含至少50%、至少70%、至少80%、至少90%胞外域胺基酸，或包含整個胞外域。
[3] 如請求項1至2中任一項之CMV gB多肽，其包含非功能跨膜(TM)結構域。
[4] 如請求項3之CMV gB多肽，其包含缺失該TM結構域之至少一部分。
[5] 如請求項4之CMV gB多肽，其中至少50%、至少70%、至少80%或至少90%該TM結構域之胺基酸缺失。
[6] 如請求項4或5之CMV gB多肽，其包含缺失SEQ ID NO:1中所述序列之位置725-775或其他CMV gB多肽中相應位置之胺基酸。
[7] 如請求項4至5中任一項之CMV gB多肽，其包含缺失SEQ ID NO:1中所述序列之位置701-775或其他CMV gB多肽中相應位置之胺基酸。
[8] 如請求項1至7中任一項之CMV gB多肽，其在該FL1結構域中包含至少一個胺基酸缺失或取代。
[9] 如請求項1至8中任一項之CMV gB多肽，其在該FL2結構域中包含至少一個胺基酸缺失或取代。
[10] 如請求項1至7之CMV gB多肽，其在該FL1結構域及該FL2結構域中均包含至少一個胺基酸缺失或取代。
[11] 如請求項1至10中任一項之CMV gB多肽，其包含缺失該細胞質域之至少一部分。
[12] 如請求項11之CMV gB多肽，其包含缺失該細胞質域之至少一個疏水性胺基酸區域。
[13] 如請求項12之CMV gB多肽，其包含缺失SEQ ID NO:1中所述序列之胺基酸825至877或其他CMV gB多肽中相應位置之胺基酸。
[14] 如請求項11之CMV gB多肽，其包含缺失至少80%、至少90%、至少95%該細胞質域胺基酸，或缺失整個細胞質域。
[15] 如請求項1至14中任一項之CMV gB多肽，其中該融合環FL1結構域中的至少一個胺基酸取代包含至少一個選自位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置155-157或其他CMV gB多肽中相應位置之Y.I.Y的胺基酸經芳族胺基酸以外的極性胺基酸取代。
[16] 如請求項15之CMV gB多肽，其中該取代包含至少兩個選自位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置155-157或其他CMV gB多肽相應位置的Y.I.Y之胺基酸經芳族胺基酸以外的極性胺基酸取代。
[17] 如請求項15或16之CMV gB多肽，其中該極性胺基酸係選自由離胺酸(K)、組胺酸(H)及精胺酸(R)組成之帶正電胺基酸之群。
[18] 如請求項17之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置156或其他CMV gB多肽中相應位置的異白胺酸(I)經組胺酸(H)取代。
[19] 如請求項17或18之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置157或其他CMV gB多肽中相應位置的酪胺酸(Y)經精胺酸(R)取代。
[20] 如請求項15至19中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置155或其他CMV gB多肽中相應位置的酪胺酸(Y)經甘胺酸(G)取代。
[21] 如請求項1至14中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之該融合環FL1結構域之位置155-157或其他CMV gB多肽中相應位置的胺基酸Y.I.Y分別經胺基酸G.H.R取代。
[22] 如請求項1至14中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之該融合環FL1結構域中之位置155-157或其他CMV gB多肽中相應位置的胺基酸Y.I.Y經具有如凱特及杜立德量表(Kyte and Doolittle scale)所測量疏水性評分小於-3、小於-7、小於-8的一段胺基酸取代。
[23] 如請求項1至22中任一項之CMV gB多肽，其中該融合環FL2結構域中的至少一個胺基酸取代包含至少一個選自位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置240-242或其他CMV gB多肽中相應位置的W.L.Y之胺基酸經選自由離胺酸(K)、組胺酸(H)及精胺酸(R)組成之群的帶正電胺基酸取代。
[24] 如請求項23之CMV gB多肽，其中選自位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置240-242或其他CMV gB多肽中相應位置的W.L.Y之胺基酸經組胺酸(H)取代。
[25] 如請求項23或24之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之位置242或其他CMV gB多肽中相應位置的酪胺酸(Y)經組胺酸(H)取代。
[26] 如請求項1至22中任一項之CMV gB多肽，其中位於SEQ ID NO:1中所述序列之該融合環FL2結構域之位置240-242或其他CMV gB多肽中相應位置的胺基酸W.L.Y分別經胺基酸A.F.H取代。
[27] 如請求項1至26中任一項之CMV gB多肽，其包含缺失前導序列之至少一部分。
[28] 如請求項27之CMV gB多肽，其包含缺失至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%該前導序列胺基酸或整個前導序列。
[29] 一種CMV gB多肽，其包含缺失至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%該前導序列胺基酸或整個前導序列。
[30] 如請求項29之CMV gB多肽，其進一步包含如請求項1至26中任一項之CMV gB多肽的一或多個特徵。
[31] 一種CMV gB多肽，其具有選自由以下所述之序列組成之群的序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21。
[32] 一種包含CMV gB多肽群體之製劑，其中該群體之至少50%、至少60%或至少70%呈三聚形式。
[33] 一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至31中任一項之CMV gB多肽與適合醫藥載劑混合。
[34] 如請求項33之免疫原性組合物，其進一步包含至少一或多個選自由以下組成之群的CMV抗原：pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130或其任何組合。
[35] 如請求項33或34之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
[36] 如請求項35之免疫原性組合物，其中該佐劑包含3D-MPL及QS21於脂質體調配物中。
[37] 如請求項35之免疫原性組合物，其中該佐劑包含水包油乳液。
[38] 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至31中任一項之CMV gB多肽。
[39] 一種聚核苷酸，其具有選自由以下所述之序列組成之群的序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17。
[40] 一種重組載體，其包含如請求項38或39之聚核苷酸。
[41] 一種宿主細胞，其經如請求項40之重組載體轉型。
[42] 如請求項1至31中任一項之CMV gB多肽，其係用於預防及/或治療CMV感染。
[43] 如請求項33至37中任一項之免疫原性組合物，其係用於預防及/或治療CMV感染。
[44] 一種如請求項1至31中任一項之CMV gB多肽或如請求項33至37中任一項之組合物之用途，其係用於製備用以預防及/或治療CMV感染之藥物。
[45] 如請求項44之用途，其係用於預防新生兒之先天性CMV感染。
[46] 如請求項44或45之用途，其中該藥物係用於投與CMV血清陰性個體。
[47] 如請求項46之用途，其中該CMV血清陰性個體為育齡期婦女。
[48] 如請求項46之用途，其中該CMV血清陰性個體為青春期少女。

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